Маркер размера молекулярной массы

Маркер размера молекулярной массы , также называемый лестницей белка , лестницей ДНК или лестницей РНК , представляет собой набор стандартов , которые используются для определения приблизительного размера молекулы , пробегающей по гелю во время электрофореза , используя принцип , что молекулярная масса обратно пропорциональна скорости миграции через гелевую матрицу. Таким образом, при использовании в гель-электрофорезе маркеры эффективно обеспечивают логарифмическую шкалу , по которой можно оценить размер других фрагментов (при условии, что известны размеры фрагментов маркера).

Маркеры белков, ДНК и РНК с заранее определенными размерами фрагментов и концентрациями имеются в продаже. Их можно запускать в агарозных или полиакриламидных гелях . Маркеры загружаются в дорожки, смежные с дорожками образцов, до начала запуска.

Хотя концепция маркеров молекулярной массы сохранилась, методы разработки менялись на протяжении многих лет. Новые изобретения маркеров молекулярной массы распространяются в наборах, специфичных для типа маркера.

Ранней проблемой в разработке маркеров было достижение высокого разрешения по всей длине маркера. ^[1] В зависимости от условий проведения гель-электрофореза фрагменты могли быть сжаты, что нарушало четкость. Для решения этой проблемы в 1990 году был разработан набор для анализа Саузерн-блоттинга , предоставляющий первый маркер для объединения целевой ДНК и зондовой ДНК. Эта техника использовала преимущество логарифмического интервала и могла использоваться для идентификации целевых полос длиной более 20 000 нуклеотидов . ^[2]

Существует два распространенных метода построения маркера размера молекулярной массы ДНК. ^[3] Один из таких методов использует технику частичного лигирования . ^[3] Лигирование ДНК - это процесс, при котором линейные фрагменты ДНК соединяются друг с другом с помощью ковалентных связей ; более конкретно, эти связи являются фосфодиэфирными связями . ^[4] Здесь фрагмент дуплекса ДНК размером 100 п.н. частично лигируется. Следствием этого является то, что образуются димеры из 200 п.н., тримеры из 300 п.н., тетрамеры из 400 п.н., пентамеры из 500 п.н. и т.д. Кроме того, часть двухцепочечной ДНК размером 100 п.н. останется. В результате на геле создается «лестница» ДНК, состоящая из фрагментов ДНК с известной молекулярной массой . ^[3]

Второй метод использует использование рестриктаз и распознаваемой последовательности ДНК. ^[3] ДНК расщепляется определенным рестриктазой, в результате чего получаются фрагменты ДНК с различной молекулярной массой. Одним из преимуществ этого метода является то, что можно легко создать больше маркеров, просто расщепляя больше известной ДНК. ^[3] С другой стороны, размер фрагментов ДНК зависит от участков, которые разрезает рестриктаза. Это затрудняет контроль размера фрагментов в маркере. ^[5]

Совсем недавно лаборатории начали использовать другой метод построения маркеров размера молекулярной массы ДНК. Эта стратегия включает использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) . ^[5] Это достигается одним или двумя способами: 1) целевая ДНК амплифицируется одновременно с помощью наборов праймеров или 2) различные целевые ДНК амплифицируются независимо с помощью определенных праймеров. ^[5]

Как и в случае с экспериментальными образцами, условия геля могут влиять на маркер размера молекулярной массы, который идет рядом с ними. Такие факторы, как буфер , заряд/ напряжение и концентрация геля, могут влиять на подвижность и/или внешний вид вашего маркера/лестницы/стандарта. Эти элементы необходимо учитывать при выборе маркера и при анализе конечных результатов на геле.

Буферы

Буферы действуют для 1) установления pH и 2) обеспечения ионов для поддержания проводимости. В электрофорезе ДНК TAE (Трис-ацетат-ЭДТА) и TBE (Трис-борат-ЭДТА) являются обычными буферами выбора. ^[6] Буфер TBE предпочтителен для небольших фрагментов ДНК, тогда как TAE лучше подходит для фрагментов более 1500 пар оснований. С точки зрения буферной емкости TAE ниже по сравнению с TBE; это обычно приводит к более медленной подвижности ДНК. TBE также способен к лучшему разрешению. ^[7]

Следует отметить, что вода не может выступать в качестве замены одного из этих буферов, поскольку ДНК не будет мигрировать по гелю. ^[6] Кроме того, использование воды вместо буфера приведет к плавлению геля . ^[8]

Заряд/Напряжение

Что касается напряжения, рекомендуемый диапазон составляет от 4 до 10 В/см (т.е. вольт/см). ^[8] Агарозные гели обычно работают при напряжении 5 В/см. ^{[3] [6]} Единица измерения расстояния, см , относится к расстоянию между электродами (т.е. анодом и катодом ), а не к длине самого геля. ^{[3] [6]}

Напряжения, которые слишком сильно ниже или выше этого диапазона, повлияют на подвижность и разрешение полос. Низкие напряжения уменьшат подвижность и приведут к расширению полос. С другой стороны, высокие напряжения уменьшат разрешение полос. Это в значительной степени связано с тем, что слишком высокие напряжения могут вызвать перегрев геля и даже расплавление. ^[8]

Концентрация

При выборе маркера необходимо учитывать концентрацию агарозы. Процент геля влияет на миграцию ДНК. ^{[3] [6]} Как правило, чем выше концентрация геля, тем медленнее скорость, с которой ДНК будет перемещаться через гель. Это в дополнение к роли, которую молекулярный вес играет в миграции маркера или образца ДНК, то есть, чем выше молекулярный вес, тем медленнее будет перемещаться ДНК. ^{[3] [6]}

Концентрация геля также влияет на способность визуализировать полосы, выходящие из геля. Меньшие полосы лучше разрешаются на геле с более высоким процентным содержанием, тогда как полосы с увеличенным молекулярным весом легче визуализировать на геле с более низким процентным содержанием. ^[6]

Ранее маркеры белков разрабатывались с использованием различных целых белков. Разработка набора, включающего маркер размера молекулярной массы на основе фрагментов белков, началась в 1993 году. Этот маркер белков, состоящий из 49 различных аминокислотных последовательностей, включал многодоменные белки и позволял анализировать белки, расщепленные в разных местах. ^[9]

Современные усовершенствования техники в маркерах белков включают использование авторазработки. Первый авторазработанный маркер белка с регулярным весом был изобретен в 2012 году. ^[10]

Подобно ДНК-маркерам, эти маркеры обычно состоят из очищенных белков, молекулярные массы которых уже известны. ^[3] В приведенном ниже списке перечислены некоторые белки, а также молекулярные массы, которые обычно используются при построении белкового маркера.

Маркеры размера молекулярной массы можно разделить на две категории: маркеры размера молекулярной массы и маркеры молекулярной лестницы. ^[14] Маркеры бывают окрашенными и неокрашенными, и в зависимости от обстоятельств один может быть более подходящим, чем другой. Маркеры размера молекулярной массы также могут быть биохимически изменены. ^[15] Наиболее распространенным является сопряжение с биотином . Маркеры размера молекулярной массы чаще всего используются в электрофорезе в полиакриламидном геле SDS и вестерн-блоттинге . При всех различных типах и применениях маркеров размера молекулярной массы важно выбрать подходящий белковый стандарт. Помимо наиболее распространенного использования, как способа расчета молекулярной массы образцов, другие применения включают получение визуальных доказательств миграции и эффективности переноса белка и иногда даже используются для положительного контроля. ^[16]

Маркер MW против белковых лестниц

Маркер молекулярной массы — это один из типов белковых стандартов. Они могут быть предварительно окрашены или неокрашены перед загрузкой; в зависимости от типа эксперимента один из них может быть более выгодным. В любом случае они обычно запускаются на внешней дорожке геля, в то время как образец загружается на средние дорожки. ^[14] Молекулярные маркеры отличаются от белковых лестниц тем, что они состоят из смеси нативных белков, характеристики которых хорошо классифицированы, но не соответствуют целым числам. ^[14] Обычно они намного дешевле, но анализ позволяет получить только приблизительное значение разделенных электрофорезом белков. ^[14]

Белковая лестница — это еще один тип белкового стандарта. Они почти всегда окрашены. ^[14] Белковые лестницы отличаются от молекулярных маркеров тем, что они состоят из смеси высокоочищенных белков, спецификации которых известны и соответствуют целым числам. ^[14] Обычно белковые лестницы состоят из 10-12 белков. ^[14] В конце эксперимента, после того как произойдет миграция размера, одна полоса будет представлять размер каждого белка, содержащегося в лестнице. ^[17] Маркеры равномерно распределены, и анализ размера с использованием этих маркеров позволяет получить точное значение интересующего белка. В некоторых случаях, в качестве метода молекулярного подтверждения, маркеры MW запускаются с белковыми лестницами для проверки. ^[14]

Предварительно окрашенные и неокрашенные маркеры

Белковые маркеры могут быть неокрашенными или предварительно окрашенными, но оба варианта имеют свои преимущества и недостатки. ^[18] Простая визуализация разделения и переноса белков возможна благодаря использованию предварительно окрашенных маркеров. ^[18] Они обычно используются как в электрофорезе в полиакриламидном геле SDS, так и в вестерн-блоттинге. В SDS-PAGE он позволяет контролировать миграцию белков, поскольку полосы белков разделяются и могут быть видны во время электрофореза. В вестерн-блоттинге окрашенные стандарты белков позволяют визуализировать перенос белков на мембрану. ^[17] Однако определения размера не столь точны с этими маркерами (см. раздел «Рекомбинантные и натуральные маркеры» для получения дополнительных объяснений). ^[18]

Хотя неокрашенные маркеры позволяют более точно определять размер, их нельзя увидеть во время работы геля. Таким образом, гель должен быть окрашен, чтобы визуализировать полосы. ^[19]

Рекомбинантные и природные маркеры

Помимо окрашенных и неокрашенных маркеров, белковые маркеры можно рассматривать в терминах рекомбинантных и природных. ^[18] Рекомбинантные маркеры состоят из рекомбинантных белков, которые были в значительной степени очищены. Эти маркеры разработаны таким образом, чтобы выделять определенные характеристики. ^[18] Примерами этих характеристик являются метки сродства и молекулярные веса, которые равномерно расположены относительно друг друга. ^[18]

Натуральные маркеры, как следует из названия, представляют собой смесь белков, которые встречаются в природе. ^[18] Предварительно окрашенные натуральные маркеры хорошо подходят для визуализации разделения геля. Однако эти маркеры имеют тенденцию связываться с красителем ковалентным образом в разных количествах и в разных положениях. ^[18] Следовательно, полученные полосы могут быть шире. Это особенно верно при сравнении с предварительно окрашенными рекомбинантными маркерами. Из-за этого эффекта определения молекулярной массы, вероятно, будут менее точными с предварительно окрашенными натуральными маркерами. ^[18]

Биохимически измененный

Стандарты белков также могут быть химически изменены. Распространенное изменение происходит с использованием биотина . Биотин имеет очень высокое сродство к стрептавидину , и поэтому связывание образует очень прочный комплекс. Для визуализации к стрептавидину прикрепляется цветная метка. ^[15]

Как и в случае электрофореза ДНК, при выборе белкового маркера следует учитывать такие условия, как буферы, заряд/напряжение и концентрация.

Буферы

Буферы могут влиять на подвижность как маркера, так и образцов. pH буфера меняется в зависимости от используемой системы, и, следовательно, каждая буферная система будет иметь разный эффект на заряд белка или белков. ^[20] Кроме того, в случае SDS-PAGE на связывающую способность SDS может влиять буферная система. ^[20] Даже при использовании того же процентного содержания и типа геля одни и те же белки будут мигрировать с разной скоростью в зависимости от используемого буфера. ^[20]

Заряд/Напряжение

Напряжение играет роль в подвижности белков в геле. Белки будут мигрировать быстрее при более высоком напряжении. Следовательно, время работы геля будет короче. И наоборот, более высокое напряжение может привести к большей диффузии полос. ^[20] Кроме того, если напряжение слишком высокое, температура в камере электрофореза может стать такой, что гель начнет плавиться. ^[20]

Напряжение, при котором должен работать гель, зависит от типа геля. Для некоторых гелей напряжение остается постоянным на протяжении всего цикла, тогда как для других гелей начальное напряжение остается постоянным в течение определенного времени, прежде чем его увеличат. ^[20] Это второе напряжение затем используется в течение определенного периода времени, после чего его также можно увеличить. ^[20]

Концентрация

С точки зрения процентного содержания гели, используемые для электрофореза белков, можно разделить на однопроцентные гели и градиентные гели. ^[18] Однопроцентные гели также называют линейными гелями. ^[20] Для линейных гелей выбранный процент обычно находится в пределах от 7,5% до 20%. ^[18] Обычные процентные диапазоны для градиентных гелей составляют 4-15% и 10-20%. Каждый тип геля имеет свои преимущества. ^[18] Например, линейные гели предпочтительны, когда несколько белков имеют схожую молекулярную массу; лучшее разделение между этими белками будет показано линейным гелем. ^[18] С другой стороны, градиентные гели являются лучшим выбором, когда интересующие образцы содержат белки с существенно разной молекулярной массой или которые охватывают большой диапазон молекулярной массы. ^{[18] [20]}

Лестницы РНК, состоящие из маркеров размера молекулярной массы РНК, изначально были разработаны с использованием метода синтетического круга ^[21] для получения маркеров разного размера. Этот метод был усовершенствован изобретателем Эриком Т. Кулом для использования кольцевых векторов ДНК в качестве метода получения маркеров размера молекулярной массы РНК. Как известно, метод катящегося круга, усовершенствования этого метода обусловлены его эффективностью в синтезе олигонуклеотидов РНК . Из кольцевой матрицы ДНК можно получить одноцепочечную РНК длиной от 4 до 1500 п.н. без необходимости использования праймеров и путем рециркуляции нуклеотидтрифосфата . ДНК также можно синтезировать из кольцевой матрицы, что добавляет универсальности этому методу. По сравнению с транскрипцией стока , метод синтетического круга производит олигонуклеотиды РНК без стока. По сравнению с ПЦР , метод синтетического круга производит олигонуклеотиды РНК без необходимости использования полимеразы или термоциклера . Этот метод также экономически эффективен, поскольку позволяет синтезировать большие объемы продукта с меньшим уровнем ошибок, чем машинные синтезаторы. ^[21]

Маркеры РНК состоят из транскриптов РНК различной увеличивающейся длины. Например, маркер Lonza 0,5-9 кб ^[22] имеет полосы, маркирующие 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6 и 9 пар килобаз . Маркеры растворяются в буфере для хранения, таком как ЭДТА , и могут иметь срок годности до 2 лет при хранении при температуре -80 °C. Чтобы использовать маркер, например, для анализа нозерн-блоттинга, его сначала размораживают , а затем окрашивают так, чтобы его можно было обнаружить с помощью гель-электрофореза. Одним из наиболее распространенных красителей, используемых для маркеров, является бромистый этидий .

Диапазон конкретного маркера относится к разнообразию полос, которые он может картировать. «Высокий» диапазон относится к относительно большим фрагментам (измеряемым в кб), тогда как «низкий» диапазон относится к маркерам, которые различают небольшие фрагменты (измеряемые в п.н.). Некоторые маркеры можно даже описать как «сверхнизкий диапазон», ^[16], но еще более точным является маркер микроРНК. Маркер микроРНК может использоваться для измерения фрагментов РНК в пределах дюжины нуклеотидов, например, маркер микроРНК 17-25 нт. ^[23]

При эквивалентных молекулярных весах РНК будет мигрировать быстрее, чем ДНК. Однако и РНК, и ДНК имеют отрицательный линейный наклон между расстоянием миграции и логарифмическим молекулярным весом. ^[24] То есть образцы с меньшим весом способны мигрировать на большее расстояние. Это соотношение следует учитывать при выборе маркеров РНК или ДНК в качестве стандарта.

При запуске РНК-маркеров и образцов РНК на геле важно предотвратить загрязнение нуклеазой , поскольку РНК очень чувствительна к деградации рибонуклеазы (РНКазы) через катализ . ^{[25] [26]} Таким образом, все материалы, которые будут использоваться в процедуре, должны быть приняты во внимание. Любая стеклянная посуда, которая должна контактировать с РНК, должна быть предварительно обработана диэтилпирокарбонатом (DEPC), а пластиковые материалы должны быть одноразовыми. ^[25]

Одним из наиболее распространенных применений маркеров размера молекулярной массы является гель-электрофорез. Целью гель-электрофореза является разделение белков по физическим или химическим свойствам , которые включают заряд, размер молекулы и pH . При разделении на основе размера идеальным методом является SDS-PAGE или электрофорез в полиакриламидном геле , а маркеры размера молекулярной массы являются подходящими стандартами для использования.

Гели могут различаться по размеру. Количество образцов, которые будут запущены, определит соответствующий размер геля. Все гели разделены на дорожки, которые проходят параллельно через гель. Каждая дорожка будет содержать определенный образец. Обычно стандарты размера молекулярной массы помещаются на внешнюю дорожку. Если гель имеет особенно большое количество дорожек, то несколько лестниц могут быть размещены поперек геля для большей прозрачности.

Белки и стандарты пипетируются на гель в соответствующие дорожки. Додецилсульфат натрия (SDS) взаимодействует с белками, денатурируя их и придавая им отрицательный заряд. Поскольку все белки имеют одинаковое отношение заряда к массе, подвижность белка через гель будет основываться исключительно на молекулярном весе. После включения электрического поля начнется миграция белка. После завершения можно использовать механизм обнаружения, такой как вестерн-блоттинг, который выявит наличие полос. Каждая полоса представляет собой определенный белок. Расстояние перемещения основано исключительно на молекулярном весе; поэтому молекулярный вес каждого белка можно определить, сравнив расстояние неизвестного белка со стандартом известной молекулярной массы. ^[27]

Существует множество видов маркеров размера молекулярной массы, и каждый из них обладает уникальными характеристиками, что позволяет использовать его в ряде биологических методик. Выбор маркера размера молекулярной массы зависит от типа маркера (ДНК, РНК или белок) и диапазона длин, который он предлагает (например, 1 кб). Перед выбором маркера размера молекулярной массы важно ознакомиться с этими характеристиками и свойствами. В конкретном случае один тип может быть более подходящим, чем другой. Хотя конкретные маркеры могут различаться в разных протоколах для данной методики, в этом разделе будут описаны общие маркеры и их роли.

Первым типом молекулярных маркеров, разработанных и запущенных в гель-электрофорезе, были аллозимы . Эти маркеры используются для обнаружения вариаций белков. Слово «аллозим» (также известное как «аллофермент») происходит от « аллельных вариантов ферментов ». ^[28] При запуске в геле белки разделяются по размеру и заряду. Хотя аллозимы могут показаться устаревшими по сравнению с другими доступными маркерами, они все еще используются сегодня, в основном из-за их низкой стоимости. Одним из основных недостатков является то, что, поскольку доступно только ограниченное количество, специфичность является проблемой. ^[28]

Хотя аллозимы могут обнаруживать вариации в ДНК, это делается косвенным методом и не очень точно. Маркеры на основе ДНК были разработаны в 1960-х годах. ^[28] Эти маркеры гораздо более эффективны для различения вариантов ДНК. Сегодня это наиболее часто используемые маркеры. Маркеры на основе ДНК работают, исследуя нуклеотиды, которые могут выполнять различные функции, такие как обнаружение различий в нуклеотидах или даже количественная оценка числа мутаций . ^[28]

ПДРФ

Полиморфизм длины фрагментов рестрикции — это метод, используемый для обнаружения вариаций в гомологичной ДНК. ^[29] Для переваривания ДНК используются специфические эндонуклеазы рестрикции. Молекулярный маркер RFLP специфичен для одного фрагмента. Наряду с аллельными маркерами RFLP, маркер размера молекулярной массы, в данном случае ДНК-маркер, ^[30] также включен в электрофорезный агарозный гель . ДНК-маркер позволяет оценить размер фрагментов рестрикции.

Миниспутники

Подобно RFLP, эта техника также использует эндонуклеазы рестрикции для переваривания геномной ДНК. Минисателлиты представляют собой короткие последовательности тандемных повторов, приблизительно 10-60 пар оснований. Минисателлиты могут использоваться в ДНК-отпечатках и в качестве регуляторов контроля генов. ^[28]

Успех маркеров на основе ДНК привел к развитию ПЦР. ПЦР ( полимеразная цепная реакция ) — это метод амплификации ДНК , который можно применять к различным типам фрагментов. До этого развития для амплификации ДНК ее приходилось клонировать или изолировать. Вскоре после открытия ПЦР возникла идея использовать маркеры на основе ПЦР для гель-электрофореза. Эти типы маркеров основаны на праймерах ПЦР и относятся к категории полиморфизма последовательности ДНК . ^[28]

Микроспутники

Также известные как SSR ( простые повторы последовательностей ) или STR ( короткие тандемные повторы ), микросателлиты отличаются от минисателлитов тем, что они короче, обычно 2-6 пар оснований. Это свойство микросателлитов позволяет легко изолировать их. Микросателлиты чаще всего используются в популяционной генетике . Микросателлиты имеют высокую и сложную скорость мутаций, что является их основным недостатком. ^[28]

АФЛП

Полиморфизм длины амплифицированного фрагмента — это метод ДНК-фингерпринтинга на основе ПЦР . Сначала ДНК расщепляется эндонуклеазами. Затем фрагменты рестрикции лигируются вместе. ^{[31] Затем, когда для} амплификации выбираются определенные фрагменты, генерируется молекулярный маркер . Маркеры AFLP запускаются вместе с маркером ДНК на геле. Обычный маркер ДНК AFLP имеет длину 30–330 п.н. ^[32] Фрагменты этого маркера располагаются с интервалом в 10 п.н. для повышения точности.

РАПД

Случайная амплификация полиморфной ДНК — это метод, который проводится аналогично AFLP. Разница в том, что молекулярные маркеры генерируются случайным образом. ^[31] Наиболее распространенным маркером размера молекулярной массы для этого метода является лестница ДНК размером 1 кб. ^{[33] [34]}

Хотя технически говоря, полиморфизм последовательности ДНК существует с момента использования RFLP в 1960-х годах, анализ значительно изменился за эти годы. Полиморфизм последовательности ДНК использует старые методы, такие как RFLP, но в большем масштабе. Секвенирование намного быстрее и эффективнее. Анализ автоматизирован, так как он использует метод, известный как секвенирование дробовиком. Этот высокопроизводительный метод обычно используется в популяционной генетике. ^[28]

SNP

SNP ( полиморфизм отдельных нуклеотидов ) используются для обнаружения вариаций в отдельных нуклеотидах. Метод очень похож на метод RFLP. SNP часто используются для популяционно-генетических исследований. ^[35] После амплификации с помощью ПЦР эти небольшие фрагменты можно визуализировать с помощью гель-электрофореза, и снова маркеры ДНК играют роль в определении длины фрагмента.

Углеводные маркеры используются в методике, известной как анализ полисахаридов с помощью электрофореза в углеводном геле (PACE), которая является измеримой методикой разделения. ^[36] Она позволяет проводить анализ продуктов ферментативного гидролиза . ^[36] Она использовалась в таких приложениях, как характеристика ферментов, участвующих в деградации гемицеллюлозы , определение структуры полисахаридов гемицеллюлозы и анализ ферментативного расщепления продуктов целлюлозы . ^[36]

PACE зависит от дериватизации, которая является преобразованием химического соединения в производное . ^{[36] [37]} Здесь моносахариды , олигосахариды и полисахариды являются интересующими соединениями. Они помечены на своих восстанавливающих концах флуоресцентной меткой (т. е. флуорофором ). ^[36] Эта дериватизация с флуорофором позволяет как разделять на геле при желаемых обстоятельствах, так и получать флуоресцентные изображения геля. В этом случае используется полиакриламидный гель. ^[36]

Как и в случае с электрофорезом ДНК, РНК и белков, маркеры запускаются вместе с образцами, представляющими интерес, в электрофорезе углеводного геля. ^[36] Маркеры состоят из олигосахаридов с известной молекулярной массой. Как и образцы, представляющие интерес, маркер также дериватизируется с помощью флуорофора (обычно с помощью 8-аминонафталин - 1,3,6- трисульфоновой кислоты (ANTS) или 2- аминоакридона ). ^[36]