Электрофорез в полиакриламидном геле
Аналитическая техника

Фотография SDS-PAGE. Молекулярные маркеры (лестница) находятся в левой полосе.

Электрофорез в полиакриламидном геле ( PAGE ) — это метод, широко используемый в биохимии , судебной химии , генетике , молекулярной биологии и биотехнологии для разделения биологических макромолекул , обычно белков или нуклеиновых кислот , в соответствии с их электрофоретической подвижностью . Электрофоретическая подвижность является функцией длины, конформации и заряда молекулы. Электрофорез в полиакриламидном геле — это мощный инструмент, используемый для анализа образцов РНК. Когда полиакриламидный гель денатурируется после электрофореза, он предоставляет информацию о составе образца видов РНК. [1]

Гидратация акрилонитрила приводит к образованию молекул акриламида ( C3H5NO ) нитрилгидратазой . [2] Мономер акриламида находится в порошкообразном состоянии до добавления воды. Акриламид токсичен для нервной системы человека, поэтому при работе с ним необходимо соблюдать все меры безопасности. Акриламид растворим в воде и при добавлении инициаторов свободных радикалов полимеризуется, что приводит к образованию полиакриламида. [ 2 ] Полезно изготавливать полиакриламидный гель путем гидратации акриламида, поскольку размер пор можно регулировать. Повышенные концентрации акриламида приводят к уменьшению размера пор после полимеризации. Полиакриламидный гель с небольшими порами помогает лучше исследовать более мелкие молекулы, поскольку небольшие молекулы могут проникать в поры и проходить через гель, в то время как крупные молекулы задерживаются в отверстиях пор.

Как и во всех формах гель-электрофореза , молекулы могут запускаться в их нативном состоянии , сохраняя структуру молекул более высокого порядка. Этот метод называется нативным-ПААГ. В качестве альтернативы можно добавить химический денатурант, чтобы удалить эту структуру и превратить молекулу в неструктурированную молекулу, подвижность которой зависит только от ее длины (потому что все комплексы белок-SDS имеют схожее отношение массы к заряду). Эта процедура называется SDS-PAGE . Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) — это метод разделения молекул, основанный на разнице их молекулярной массы. При pH, при котором проводится гель-электрофорез, молекулы SDS заряжены отрицательно и связываются с белками в установленном соотношении, приблизительно одна молекула SDS на каждые 2 аминокислоты. [3] : 164–79  Таким образом, детергент обеспечивает всем белкам равномерное отношение заряда к массе. Связываясь с белками, детергент разрушает их вторичную, третичную и/или четвертичную структуру, денатурируя их и превращая в отрицательно заряженные линейные полипептидные цепи. При воздействии электрического поля в ПААГ отрицательно заряженные полипептидные цепи движутся к аноду с различной подвижностью. Их подвижность, или расстояние, пройденное молекулами, обратно пропорциональна логарифму их молекулярной массы. [4] Сравнивая относительное отношение расстояния, пройденного каждым белком, к длине геля (Rf), можно сделать выводы об относительной молекулярной массе белков, где длина геля определяется расстоянием, пройденным небольшой молекулой, такой как следящий краситель. [5]

Для нуклеиновых кислот мочевина является наиболее часто используемым денатурирующим веществом. Для белков додецилсульфат натрия (SDS) является анионным детергентом, применяемым к образцам белков для покрытия белков с целью придания двух отрицательных зарядов (от каждой молекулы SDS) к каждым двум аминокислотам денатурированного белка. [3] : 161–3  2-меркаптоэтанол также может использоваться для разрушения дисульфидных связей, обнаруженных между белковыми комплексами, что способствует дальнейшей денатурации белка. В большинстве белков связывание SDS с полипептидными цепями обеспечивает равномерное распределение заряда на единицу массы, тем самым приводя к фракционированию по приблизительному размеру во время электрофореза. Белки, которые имеют более высокое гидрофобное содержание, например, многие мембранные белки и те, которые взаимодействуют с поверхностно-активными веществами в своей родной среде, по своей природе сложнее точно обрабатывать с помощью этого метода из-за большей изменчивости в соотношении связанного SDS. [6] Процедурно, совместное использование Native и SDS-PAGE может быть использовано для очистки и разделения различных субъединиц белка. Native-PAGE сохраняет олигомерную форму нетронутой и покажет полосу на геле, которая является репрезентативной для уровня активности. SDS-PAGE денатурирует и разделяет олигомерную форму на ее мономеры, показывая полосы, которые являются репрезентативными для их молекулярных масс. Эти полосы могут быть использованы для идентификации и оценки чистоты белка. [3] : 161–3 

Процедура

Подготовка образца

Образцы могут быть любым материалом, содержащим белки или нуклеиновые кислоты. Они могут быть получены биологическим путем, например, из прокариотических или эукариотических клеток, тканей, вирусов, образцов окружающей среды или очищенных белков. В случае твердых тканей или клеток их часто сначала механически разрушают с помощью блендера (для больших объемов образцов), с помощью гомогенизатора (меньшие объемы), с помощью соникатора или с помощью циклирования высокого давления, а комбинация биохимических и механических методов, включая различные типы фильтрации и центрифугирования , может использоваться для разделения различных клеточных отсеков и органелл перед электрофорезом. Синтетические биомолекулы, такие как олигонуклеотиды, также могут использоваться в качестве аналитов.

Восстановление типичной дисульфидной связи с помощью ДТТ посредством двух последовательных реакций тиол-дисульфидного обмена .

Образец для анализа может быть по желанию смешан с химическим денатурантом, обычно это SDS для белков или мочевина для нуклеиновых кислот. SDS — это анионный детергент , который денатурирует вторичные и не связанные дисульфидными связями третичные структуры и дополнительно наносит отрицательный заряд на каждый белок пропорционально его массе. Мочевина разрушает водородные связи между парами оснований нуклеиновой кислоты, заставляя составляющие ее нити разделяться. Нагревание образцов по крайней мере до 60 °C еще больше способствует денатурации. [7] [8] [9] [10]

В дополнение к SDS белки могут быть необязательно нагреты до температуры, близкой к кипению, в присутствии восстановителя, такого как дитиотреитол (DTT) или 2-меркаптоэтанол (бета-меркаптоэтанол/BME) , который дополнительно денатурирует белки, восстанавливая дисульфидные связи, тем самым преодолевая некоторые формы третичного сворачивания белка и разрушая четвертичную структуру белка (олигомерные субъединицы). Это известно как восстанавливающий SDS-PAGE.

В раствор может быть добавлен отслеживающий краситель. Обычно он имеет более высокую электрофоретическую подвижность, чем аналиты, что позволяет экспериментатору отслеживать движение раствора через гель во время электрофоретического цикла.

Приготовление акриламидных гелей

Гели обычно состоят из акриламида , бисакриламида , необязательного денатурирующего агента (SDS или мочевины) и буфера с отрегулированным pH. Раствор может быть дегазирован под вакуумом, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха во время полимеризации. В качестве альтернативы, бутанол может быть добавлен в разделяющий гель (для белков) после его заливки, так как бутанол удаляет пузырьки и делает поверхность гладкой. [11] Источник свободных радикалов и стабилизатор, такой как персульфат аммония и TEMED , добавляются для инициирования полимеризации. [12] Реакция полимеризации создает гель из-за добавленного бисакриламида , который может образовывать поперечные связи между двумя молекулами акриламида. Соотношение бисакриламида к акриламиду может варьироваться для специальных целей, но обычно составляет около 1 части на 35. Концентрация акриламида в геле также может варьироваться, как правило, в диапазоне от 5% до 25%. Гели с более низким процентным содержанием лучше подходят для разделения молекул с очень высокой молекулярной массой, в то время как для разделения более мелких белков требуются гораздо более высокие процентные содержания акриламида. Средний диаметр пор полиакриламидных гелей определяется общей концентрацией акриламидов (% T, где T = общая концентрация акриламида и бисакриламида) и концентрацией сшивающего агента бисакриламида (% C, где C = концентрация бисакриламида). [13] Размер пор уменьшается обратно пропорционально % T. Что касается % C, концентрация 5% дает самые маленькие поры, поскольку влияние бисакриламида на размер пор имеет форму параболы с вершиной при 5%.

Гели обычно полимеризуются между двумя стеклянными пластинами в гелевой кастере, с гребенкой, вставленной сверху для создания лунок для образцов. После полимеризации геля гребенку можно удалить, и гель готов к электрофорезу.

Электрофорез

В PAGE используются различные буферные системы в зависимости от природы образца и экспериментальной цели. Буферы, используемые на аноде и катоде, могут быть одинаковыми или разными. [9] [14] [15]

Через гель подается электрическое поле, заставляя отрицательно заряженные белки или нуклеиновые кислоты мигрировать через гель от отрицательного электрода (который является катодом, поскольку это электролитический, а не гальванический элемент) и к положительному электроду (аноду). В зависимости от их размера каждая биомолекула движется по-разному через матрицу геля: небольшие молекулы легче проходят через поры в геле, в то время как более крупные испытывают большие трудности. Гель обычно работает в течение нескольких часов, хотя это зависит от напряжения, приложенного к гелю; миграция происходит быстрее при более высоких напряжениях, но эти результаты, как правило, менее точны, чем при более низких напряжениях. По истечении установленного времени биомолекулы мигрируют на разные расстояния в зависимости от их размера. Более мелкие биомолекулы перемещаются дальше по гелю, в то время как более крупные остаются ближе к точке происхождения. Поэтому биомолекулы можно примерно разделить по размеру, который зависит в основном от молекулярной массы в денатурирующих условиях, но также зависит от конформации более высокого порядка в нативных условиях. Подвижность геля определяется как скорость миграции, пройденной с градиентом напряжения 1 В/см, и имеет единицы измерения см2 / сек/В. [3] : 161–3  Для аналитических целей относительная подвижность биомолекул, Rf , отношение расстояния, пройденного молекулой в геле, к общему расстоянию перемещения отслеживающего красителя, строится в зависимости от молекулярной массы молекулы (или иногда логарифма MW, или, скорее, Mr , молекулярного радиуса). Такие типично линейные графики представляют собой стандартные маркеры или калибровочные кривые, которые широко используются для количественной оценки различных размеров биомолекул. [3] : 161–3 

Однако некоторые гликопротеины ведут себя аномально на гелях SDS. Кроме того, анализ более крупных белков в диапазоне от 250 000 до 600 000 Да также считается проблематичным из-за того, что такие полипептиды неправильно движутся в обычно используемых гелевых системах. [16]

Дальнейшая обработка

Два SDS-PAGE-геля после завершения цикла

После электрофореза гель может быть окрашен (для белков, чаще всего, с помощью Кумасси бриллиантового синего R-250 или авторадиографии; для нуклеиновых кислот, бромистым этидием ; или для того и другого, серебряным красителем ), что позволяет визуализировать разделенные белки, или подвергнуть дальнейшей обработке (например, вестерн-блоттинг ). После окрашивания биомолекулы разных видов появляются в виде отдельных полос в геле. Обычно маркеры размера молекулярной массы с известной молекулярной массой запускают в отдельной полосе в геле, чтобы откалибровать гель и определить приблизительную молекулярную массу неизвестных биомолекул, сравнивая пройденное расстояние относительно маркера.

Для белков SDS-PAGE обычно является первым выбором в качестве анализа чистоты из-за его надежности и простоты. Присутствие SDS и денатурирующего этапа разделяет белки, приблизительно на основе размера, но может происходить аберрантная миграция некоторых белков. Различные белки также могут окрашиваться по-разному, что мешает количественной оценке путем окрашивания. PAGE также может использоваться в качестве препаративного метода очистки белков. Например, препаративный нативный PAGE представляет собой метод разделения нативных металлопротеинов в сложных биологических матрицах.

Химические ингредиенты и их роль

Полиакриламидный гель (ПАГ) был известен как потенциальная среда для заливки срезов тканей еще в 1964 году, и две независимые группы использовали ПАГ в электрофорезе в 1959 году. [17] [18] Он обладает несколькими электрофоретически желательными характеристиками, которые делают его универсальной средой. Это синтетический, термостабильный, прозрачный, прочный, химически относительно инертный гель, и его можно приготовить с широким диапазоном средних размеров пор. [19] Размер пор геля и воспроизводимость размера пор геля определяются тремя факторами: общим количеством присутствующего акриламида (%T) (T = общая концентрация мономера акриламида и бисакриламида), количеством сшивающего агента (%C) (C = концентрация бисакриламида) и временем полимеризации акриламида (ср. QPNC-PAGE). Размер пор уменьшается с увеличением %T; при сшивании 5%C дает наименьший размер пор. Любое увеличение или уменьшение %C от 5% увеличивает размер пор, поскольку размер пор относительно %C является параболической функцией с вершиной 5%C. По-видимому, это происходит из-за неоднородного связывания полимерных нитей внутри геля. Этот гелевый материал также может выдерживать высокие градиенты напряжения , поддается различным процедурам окрашивания и обесцвечивания и может быть подвергнут перевариванию для извлечения отдельных фракций или высушен для авторадиографии и постоянной записи.

Компоненты

Полиакриламидные гели состоят из стекирующего геля и разделяющего геля. Стекинговые гели имеют более высокую пористость по сравнению с разделяющим гелем и позволяют белкам мигрировать в концентрированной области. Кроме того, стекирующие гели обычно имеют pH 6,8, поскольку нейтральные молекулы глицина обеспечивают более быструю подвижность белков. Разделяющие гели имеют pH 8,8, где анионный глицин замедляет подвижность белков. Разделяющие гели позволяют разделять белки и имеют относительно более низкую пористость. Здесь белки разделяются на основе размера (в SDS-PAGE) и размера/заряда (Native PAGE). [20]

Химический буфер стабилизирует значение pH до желаемого значения в самом геле и в буфере электрофореза. Выбор буфера также влияет на электрофоретическую подвижность буферных противоионов и, таким образом, на разрешение геля. Буфер также должен быть инертным и не изменять или реагировать с большинством белков. Различные буферы могут использоваться в качестве катодных и анодных буферов, соответственно, в зависимости от применения. Несколько значений pH могут использоваться в одном геле, например, в DISC-электрофорезе. Обычные буферы в PAGE включают Tris , Bis-Tris или имидазол .

Противоионы уравновешивают собственный заряд буферного иона, а также влияют на напряженность электрического поля во время электрофореза. Высокозаряженные и подвижные ионы часто избегают в катодных буферах SDS-PAGE, но могут быть включены в сам гель, где они мигрируют впереди белка. В таких приложениях, как DISC SDS-PAGE, значения pH внутри геля могут меняться, чтобы изменить средний заряд противоионов во время пробега для улучшения разрешения. Популярные противоионы - глицин и трицин . Глицин использовался в качестве источника отстающего иона или медленного иона, поскольку его pKa составляет 9,69, а подвижность глицината такова, что эффективная подвижность может быть установлена ​​на уровне ниже, чем у самых медленных известных белков с чистым отрицательным зарядом в диапазоне pH. Минимальное значение pH этого диапазона составляет приблизительно 8,0.

Акриламид ( C3H5NO ; mW: 71,08) при растворении в воде происходит медленная, спонтанная автополимеризация акриламида, в результате которой молекулы соединяются по принципу «голова в хвост» с образованием длинных одноцепочечных полимеров. Наличие системы, генерирующей свободные радикалы, значительно ускоряет полимеризацию. Этот тип реакции известен как виниловая аддитивная полимеризация . Раствор этих полимерных цепей становится вязким, но не образует гель, поскольку цепи просто скользят друг по другу. Для образования геля требуется связывание различных цепей вместе. Акриламид является канцерогеном [21] , нейротоксином и репродуктивным токсином. [22] Также важно хранить акриламид в прохладном темном и сухом месте, чтобы уменьшить автополимеризацию и гидролиз .

Бисакриламид ( N , N′ -Метиленбисакриламид ) ( C7H10N2O2 ; мол . масса: 154,17) является наиболее часто используемым сшивающим агентом для полиакриламидных гелей. Химически его можно рассматривать как две молекулы акриламида , соединенные голова к голове на их нереакционноспособных концах. Бисакриламид может сшивать две полиакриламидные цепи друг с другом, тем самым образуя гель.

Додецилсульфат натрия (SDS) ( C 12 H 25 NaO 4 S ; мол. масса: 288,38) (используется только в денатурирующих белковых гелях) является сильным детергентом, используемым для денатурации нативных белков в отдельные полипептиды . Эта денатурация, которая называется реконструктивной денатурацией, достигается не путем полной линеаризации белка, а вместо этого посредством конформационного изменения в комбинацию случайных катушек и вторичных структур α-спирали. [6] Когда белковая смесь нагревается до 100 °C в присутствии SDS, детергент обволакивает полипептидный остов. Он связывается с полипептидами в постоянном весовом соотношении 1,4 г SDS/г полипептида. В этом процессе собственные заряды полипептидов становятся незначительными по сравнению с отрицательными зарядами, вносимыми SDS. Таким образом, полипептиды после обработки становятся стержнеобразными структурами, обладающими однородной плотностью заряда, то есть тем же чистым отрицательным зарядом на единицу веса. Электрофоретическая подвижность этих белков является линейной функцией логарифмов их молекулярных масс. Без SDS различные белки с одинаковой молекулярной массой мигрировали бы по-разному из-за различий в соотношении массы и заряда, поскольку каждый белок имеет изоэлектрическую точку и молекулярную массу, характерные для его первичной структуры . Это известно как нативный PAGE . Добавление SDS решает эту проблему, поскольку он связывается с белком и разворачивает его, давая почти равномерный отрицательный заряд по всей длине полипептида.

Мочевина ( CO(NH2 ) 2 ; mW: 60,06) является хаотропным агентом , который увеличивает энтропию системы, вмешиваясь во внутримолекулярные взаимодействия, опосредованные нековалентными силами , такими как водородные связи и силы Ван-дер-Ваальса . Макромолекулярная структура зависит от чистого эффекта этих сил, поэтому следует, что увеличение хаотропных растворов денатурирует макромолекулы,

Персульфат аммония ( APS) ( N2H8S2O8 ; mW : 228,2 ) является источником свободных радикалов и часто используется в качестве инициатора для образования геля. Альтернативным источником свободных радикалов является рибофлавин , который генерирует свободные радикалы в фотохимической реакции.

TEMED ( N , N , N ′ , N′ -тетраметилэтилендиамин) ( C6H16N2 ; mW : 116,21) стабилизирует свободные радикалы и улучшает полимеризацию. Скорость полимеризации и свойства полученного геля зависят от концентрации свободных радикалов. Увеличение количества свободных радикалов приводит к уменьшению средней длины полимерной цепи, увеличению мутности геля и снижению эластичности геля. Уменьшение количества показывает обратный эффект. Следует использовать самые низкие каталитические концентрации, которые позволяют полимеризацию за разумный период времени. APS и TEMED обычно используются в приблизительно эквимолярных концентрациях в диапазоне от 1 до 10 мМ.

Химикаты для обработки и визуализации

PAGE белков ротавируса, окрашенных Кумасси синим

Для обработки геля и визуализированных в нем образцов белка используются следующие химические вещества и процедуры.

Отслеживающий краситель; поскольку белки и нуклеиновые кислоты в основном бесцветны, их продвижение через гель во время электрофореза нелегко отследить. Поэтому анионные красители с известной электрофоретической подвижностью обычно включаются в буфер образца PAGE. Очень распространенным отслеживающим красителем является бромфеноловый синий (BPB, 3',3",5',5" тетрабромфенолсульфонфталеин). Этот краситель окрашивается при щелочном и нейтральном pH и представляет собой небольшую отрицательно заряженную молекулу, которая движется к аноду . Будучи высокомобильной молекулой, она движется впереди большинства белков. Когда она достигает анодного конца электрофорезной среды, электрофорез останавливается. Он может слабо связываться с некоторыми белками и придавать синий цвет. Другими распространенными отслеживающими красителями являются ксиленцианол , который имеет более низкую подвижность, и оранжевый G , который имеет более высокую подвижность.

Средства загрузки; большинство систем PAGE загружаются сверху в лунки внутри геля. Чтобы гарантировать, что образец опустится на дно геля, буфер образца дополняется добавками, которые увеличивают плотность образца . Эти добавки должны быть неионными и нереактивными по отношению к белкам, чтобы не мешать электрофорезу. Обычными добавками являются глицерин и сахароза .

Кумасси бриллиантовый синий R-250 (CBB)( C 45 H 44 N 3 NaO 7 S 2 ; мол. масса: 825,97) является самым популярным красителем для белков. Это анионный краситель, который неспецифически связывается с белками. Структура CBB преимущественно неполярная, и он обычно используется в метанольном растворе, подкисленном уксусной кислотой. Белки в геле фиксируются уксусной кислотой и одновременно окрашиваются. Избыток красителя, включенного в гель, можно удалить путем обесцвечивания тем же раствором без красителя. Белки обнаруживаются в виде синих полос на чистом фоне. Поскольку SDS также является анионным, он может мешать процессу окрашивания. Поэтому рекомендуется большой объем окрашивающего раствора, по крайней мере в десять раз превышающий объем геля.

Бромистый этидий (EtBr) — популярный краситель для нуклеиновых кислот. EtBr позволяет легко визуализировать ДНК или РНК на геле, поскольку EtBr флуоресцирует оранжевым цветом под УФ-светом. [23] Бромистый этидий связывает цепи нуклеиновых кислот посредством процесса интеркаляции. [3] Хотя бромистый этидий — популярный краситель, важно соблюдать осторожность при использовании EtBr, поскольку он является известным канцерогеном . Из-за этого факта многие исследователи предпочитают использовать такие красители, как SYBR Green и SYBR Safe, которые являются более безопасными альтернативами EtBr. [24] EtBr используется путем простого добавления его в смесь гелей. После того, как гель застынет, его можно просмотреть с помощью системы фотодокументации. [3]

Окрашивание серебром используется, когда требуется более чувствительный метод обнаружения, так как классическое окрашивание Кумасси бриллиантовым синим обычно позволяет обнаружить полосу белка 50 нг. Окрашивание серебром обычно увеличивает чувствительность в 10-100 раз. Это основано на химии фотографического проявления. Белки фиксируются на геле разбавленным раствором метанола, затем инкубируются с кислым раствором нитрата серебра. Ионы серебра восстанавливаются до металлической формы формальдегидом при щелочном pH. Кислый раствор, такой как уксусная кислота, останавливает проявление. [25] Окрашивание серебром было введено Кереньи и Галлиасом в качестве чувствительной процедуры для обнаружения следовых количеств белков в гелях . [26] Метод был распространен на изучение других биологических макромолекул , которые были разделены на различных носителях. [27] На интенсивность цвета могут влиять многие переменные , и каждый белок имеет свои собственные характеристики окрашивания; чистая стеклянная посуда, чистые реагенты и вода высочайшей чистоты являются ключевыми моментами для успешного окрашивания. [28] Окрашивание серебром было разработано в 14 веке для окрашивания поверхности стекла. Оно широко использовалось для этой цели с 16 века. Цвет, полученный ранними серебряными красителями, варьировался от светло-желтого до оранжево-красного. Камилло Гольджи усовершенствовал серебряное окрашивание для изучения нервной системы . Метод Гольджи окрашивает ограниченное количество клеток случайным образом во всей их полноте. [29]

Авторадиография, также используемая для обнаружения белковых полос после гель-электрофореза, использует радиоактивные изотопы для маркировки белков, которые затем обнаруживаются с помощью рентгеновской пленки. [30]

Вестерн-блоттинг — это процесс, при котором белки, разделенные в акриламидном геле, электрофоретически переносятся на стабильную, манипулируемую мембрану, такую ​​как нитроцеллюлозная , нейлоновая или PVDF- мембрана. Затем можно применять иммунохимические методы для визуализации перенесенных белков, а также точно определять относительное увеличение или уменьшение интересующего белка.

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Петров А, Ца А, Пуглиси Дж. Д. (2013). «Глава шестнадцатая – Анализ РНК с помощью аналитического электрофореза в полиакриламидном геле». В Lorsch J (ред.). Методы в энзимологии . Т. 530. Academic Press. С. 301–313. doi :10.1016/B978-0-12-420037-1.00016-6. ISBN 978-0-12-420037-1. PMID  24034328.
  2. ^ ab Редакторы Encyclopaedia Britannica (2017). "Полиакриламид". Britannica Online Academic Edition . Encyclopedia Britannica , Inc. {{cite book}}: |last=имеет общее название ( помощь )
  3. ^ abcdefg Ninfa AJ, Ballou DP, Benore M (2010). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии (2-е изд.). Хобокен, Нью-Джерси: John Wiley & Sons, Inc. ISBN 978-0-470-08766-4. OCLC  420027217.
  4. ^ Kindt T, Goldsby R, Osborne B (2007). Kuby Immunology . Нью-Йорк: WH Freeman and Company. стр. 553. ISBN 978-1-4292-0211-4.
  5. ^ Кумар А., Авасти А. (2009). Биосепарационная инженерия . Нью-Дели: IK International Publishing House. стр. 137. ISBN 9789380026084.
  6. ^ ab Rath A, Glibowicka M, Nadeau VG и др. (2009). «Связывание детергента объясняет аномальную миграцию мембранных белков в SDS-PAGE». Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 (6): 1760–5. Bibcode :2009PNAS..106.1760R. doi : 10.1073/pnas.0813167106 . PMC 2644111 . PMID  19181854.  
  7. ^ Шапиро AL, Виньюэла E, Майзель JV Jr (1967). «Оценка молекулярной массы полипептидных цепей электрофорезом в SDS-полиакриламидных гелях». Biochem. Biophys. Res. Commun. 28 (5): 815–20. doi :10.1016/0006-291X(67)90391-9. PMID  4861258.
  8. ^ Вебер К, Осборн М (1969). «Надежность определения молекулярной массы с помощью электрофореза в додецилсульфатном полиакриламидном геле». J Biol Chem . 244 (16): 4406–12. doi : 10.1016/S0021-9258(18)94333-4 . PMID  5806584.
  9. ^ ab Laemmli UK (1970). «Расщепление структурных белков во время сборки головки бактериофага T4». Nature . 227 (5259): 680–5. Bibcode :1970Natur.227..680L. doi :10.1038/227680a0. PMID  5432063. S2CID  3105149.
  10. ^ Caprette DR. "SDS-PAGE". Experimental Biosciences . Получено 27 сентября 2009 г.
  11. ^ "Что означает дегазация смеси акриламидного геля?". Protocol Online . 2006. Получено 28 сентября 2009 .
  12. ^ "SDS-PAGE". Архивировано из оригинала 20 февраля 2014 года . Получено 12 сентября 2009 года .
  13. ^ Rüchel R, Steere RL, Erbe EF (1978). «Наблюдения за полиакриламидными гелями, полученными методом замораживания-травления, с помощью просвечивающего электронного микроскопа». J. Chromatogr. A. 166 ( 2): 563–575. doi :10.1016/S0021-9673(00)95641-3.
  14. ^ Schägger H, von Jagow G (1987). «Трицин-додецилсульфат натрия-полиакриламидный гель-электрофорез для разделения белков в диапазоне от 1 до 100 кДа». Anal. Biochem. 166 (2): 368–379. doi :10.1016/0003-2697(87)90587-2. PMID  2449095.
  15. ^ Ancrews D (2007). "SDS-PAGE". Andrews Lab . Архивировано из оригинала 2 июля 2017 года . Получено 27 сентября 2009 года .
  16. ^ Quandt N, Stindl A, Keller U (1993). «Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия для оценки МР полипептидов с высокой молекулярной массой». Anal. Biochem. 214 (2): 490–494. doi :10.1006/abio.1993.1527. PMID  8109738.
  17. ^ Дэвис Б.Дж., Орнштейн Л. (1959). «Новый метод электрофореза высокого разрешения». Доклад, представленный в Обществе по изучению крови при Нью-Йоркской медицинской академии .
  18. ^ Raymond S, Weintraub L (1959). "Акриламидный гель как поддерживающая среда для зонного электрофореза". Science . 130 (3377): 711. Bibcode :1959Sci...130..711R. doi :10.1126/science.130.3377.711. PMID  14436634. S2CID  7242716.
  19. ^ Rüchel R, Steere RL, Erbe EF (1978). «Наблюдения за полиакриламидными гелями, полученными методом просвечивающей электронной микроскопии». J. Chromatogr. A. 166 ( 2): 563–75. doi :10.1016/S0021-9673(00)95641-3.
  20. ^ Duchesne LG, Lam JS, MacDonald LA и др. (1988). «Влияние pH и концентрации акриламида на разделение липополисахаридов в полиакриламидных гелях». Current Microbiology . 16 (4): 191–4. doi :10.1007/BF01568528. S2CID  932635.
  21. ^ Tareke E, Rydberg P, Eriksson S, et al. (2000). «Акриламид: канцероген при приготовлении пищи?». Chem. Res. Toxicol. 13 (6): 517–22. doi :10.1021/tx9901938. PMID  10858325.
  22. ^ LoPachin R (2004). «Изменение взгляда на нейротоксичность акриламида». Neurotoxicology . 25 (4): 617–30. doi :10.1016/j.neuro.2004.01.004. PMID  15183015.
  23. ^ Sabnis RW (2010). Справочник по биологическим красителям и красителям: синтез и промышленное применение . Хобокен, Нью-Джерси: Wiley-Blackwell. ISBN 978-0-470-40753-0. OCLC  647922579.
  24. ^ Singer VL, Lawlor TE, Yue S (1999). "Сравнение мутагенности геля нуклеиновой кислоты SYBR Green I и мутагенности бромистого этидия в анализе обратной мутации сальмонеллы/млекопитающих микросом (тест Эймса)". Mutat. Res. 439 (1): 37–47. doi :10.1016/s1383-5718(98)00172-7. PMID  10029672.
  25. ^ Ninfa AJ, Ballou DP (2004). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии . Хобокен, Нью-Джерси: Wiley & Sons. ISBN 978-1-891786-00-6. OCLC  633862582.
  26. ^ Кереньи Л, Галляс Ф (1973). «Убер-проблема количественного анализа агар-электрофоретограммы». Клин. Хим. Акта . 47 (3): 425–436. дои : 10.1016/0009-8981(73)90276-3. ПМИД  4744834.
  27. ^ Switzer RC 3rd, Merril CR, Shifrin S (1979). «Высокочувствительное серебряное пятно для обнаружения белков и пептидов в полиакриламидных гелях». Anal. Biochem. 98 (1): 231–7. doi :10.1016/0003-2697(79)90732-2. PMID  94518.
  28. ^ Hempelmann E, Schulze M, Götze O ​​(1984). «Свободные SH-группы важны для полихроматического окрашивания белков нитратом серебра». В Neuhof V (ред.). Electrophoresis '84 . Weinheim: Verlag Chemie. стр. 328–30.
  29. ^ Грант Г (2007). «Как Нобелевская премия по физиологии и медицине 1906 года была разделена между Гольджи и Кахалем». Brain Res Rev. 55 ( 2): 490–8. doi :10.1016/j.brainresrev.2006.11.004. PMID  17306375. S2CID  24331507.
  30. ^ Song D, Ma S, Khor SP (2002). «Анализ изображений гель-электрофореза-авторадиографического анализа концентрации радиоактивно меченого белка в сыворотке для фармакокинетических исследований». Журнал фармакологических и токсикологических методов . 47 (1): 59–66. doi :10.1016/s1056-8719(02)00203-4. PMID  12387940.
  31. ^ Minde DP (2012). «Определение биофизической стабильности белка в лизатах с помощью быстрого анализа протеолиза, FASTpp». PLOS One . 7 (10): e46147. Bibcode : 2012PLoSO...746147M. doi : 10.1371/journal.pone.0046147 . PMC 3463568. PMID  23056252 . 
На Викискладе есть медиафайлы по теме «Электрофорез в полиакриламидном геле» .
Библиотечные ресурсы по
электрофорезу в полиакриламидном геле
  • Ресурсы в вашей библиотеке
  • Ресурсы в других библиотеках
  • SDS-PAGE: как это работает
  • Разоблачающее видео SDS-PAGE
  • Разоблачение SDS-PAGE
  • Калькулятор SDS-PAGE для индивидуальных рецептов гелей TRIS Urea.
  • 2-мерный белковый гель-электрофорез
  • [1] Хемпельманн Э. SDS-белковый электрофорез в полиакриламидном геле и обнаружение белков с помощью окрашивания серебром и иммуноблоттинга белков Plasmodium falciparum. в: Moll K, Ljungström J, Perlmann H, Scherf A, Wahlgren M (ред.) Методы исследования малярии, 5-е издание, 2008 г., 263-266
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Электрофорез_в_полиакриламидном_геле&oldid=1254520295"