Вектор (молекулярная биология)
Переносит генетический материал между клетками

В молекулярном клонировании вектор — это любая частица (например, плазмиды , космиды , лямбда-фаги ), используемая в качестве транспортного средства для искусственного переноса чужеродной нуклеиновой последовательности — обычно ДНК — в другую клетку , где она может быть реплицирована и/или экспрессирована . [1] Вектор, содержащий чужеродную ДНК, называется рекомбинантной ДНК . Четыре основных типа векторов — плазмиды , вирусные векторы , космиды и искусственные хромосомы . Из них наиболее часто используемыми векторами являются плазмиды. [2] Общими для всех сконструированных векторов являются начало репликации , сайт мультиклонирования и селективный маркер .

Сам вектор обычно несет последовательность ДНК , которая состоит из вставки (в данном случае трансгена ) и более крупной последовательности, которая служит «основой» вектора. Целью вектора, который переносит генетическую информацию в другую клетку, обычно является выделение, размножение или экспрессия вставки в целевой клетке. Все векторы могут использоваться для клонирования и, следовательно, являются клонирующими векторами , но есть также векторы, разработанные специально для клонирования, в то время как другие могут быть разработаны специально для других целей, таких как транскрипция и экспрессия белка. Векторы, разработанные специально для экспрессии трансгена в целевой клетке, называются векторами экспрессии и, как правило, имеют промоторную последовательность, которая управляет экспрессией трансгена. Более простые векторы, называемые векторами транскрипции, способны только транскрибироваться, но не транслироваться: они могут реплицироваться в целевой клетке, но не экспрессироваться, в отличие от векторов экспрессии. Векторы транскрипции используются для амплификации своей вставки.

Манипуляции с ДНК обычно проводятся на векторах E. coli , которые содержат элементы, необходимые для их поддержания в E. coli . Однако векторы могут также иметь элементы, которые позволяют им поддерживаться в другом организме, таком как дрожжи, клетки растений или млекопитающих, и эти векторы называются челночными векторами . Такие векторы имеют бактериальные или вирусные элементы, которые могут быть переданы небактериальному организму-хозяину, однако другие векторы, называемые интрагенными векторами, также были разработаны, чтобы избежать передачи любого генетического материала от чужеродного вида. [3]

Введение вектора в клетку-мишень обычно называют трансформацией для бактериальных клеток [4], трансфекцией для эукариотических клеток [5] , хотя введение вирусного вектора часто называют трансдукцией. [6]

Характеристики

Плазмиды

Плазмиды — это двухцепочечные внехромосомные и, как правило, кольцевые последовательности ДНК, способные к репликации с использованием репликационного аппарата клетки-хозяина. [7] Плазмидные векторы в минимальном объеме состоят из точки начала репликации , которая допускает полунезависимую репликацию плазмиды в хозяине. Плазмиды широко распространены во многих бактериях, например, в Escherichia coli , но также могут быть обнаружены в некоторых эукариотах, например, в дрожжах, таких как Saccharomyces cerevisiae . [8] Бактериальные плазмиды могут быть конъюгативными/трансмиссивными и неконъюгативными:

  • конъюгативные — опосредуют перенос ДНК посредством конъюгации и, следовательно, быстро распространяются среди бактериальных клеток популяции; например, плазмида F, многие плазмиды R и некоторые плазмиды col.
  • неконъюгативные - не опосредуют ДНК посредством конъюгации, например, многие плазмиды R и col.
Плазмида pBR322 — одна из первых плазмид, широко используемых в качестве вектора клонирования .

Плазмиды со специально сконструированными характеристиками обычно используются в лабораторных условиях для клонирования . Эти плазмиды, как правило, неконъюгативные, но могут иметь гораздо больше характеристик, в частности, « множественный сайт клонирования », где множественные сайты расщепления ферментом рестрикции позволяют вставлять трансгенную вставку. Бактерии, содержащие плазмиды, могут генерировать миллионы копий вектора внутри бактерий за часы, а амплифицированные векторы могут быть извлечены из бактерий для дальнейших манипуляций. Плазмиды могут использоваться специально в качестве векторов транскрипции, и такие плазмиды могут не иметь критических последовательностей для экспрессии белка. Плазмиды, используемые для экспрессии белка, называемые векторами экспрессии , будут включать элементы для трансляции белка, такие как сайт связывания рибосомы , стартовые и стоп-кодоны .

Вирусные векторы

Вирусные векторы — это генетически сконструированные вирусы, несущие модифицированную вирусную ДНК или РНК, которая была сделана неинфекционной, но все еще содержит вирусные промоторы и трансген, что позволяет транслировать трансген через вирусный промотор. Однако, поскольку вирусные векторы часто не имеют инфекционных последовательностей, им требуются вспомогательные вирусы или упаковочные линии для крупномасштабной трансфекции. Вирусные векторы часто разрабатываются для постоянного включения вставки в геном хозяина и, таким образом, оставляют различные генетические маркеры в геноме хозяина после включения трансгена. Например, ретровирусы оставляют характерный ретровирусный паттерн интеграции после вставки, который можно обнаружить и который указывает на то, что вирусный вектор включился в геном хозяина.

Искусственные хромосомы

Искусственные хромосомы — это изготовленные хромосомы в контексте искусственных хромосом дрожжей (YAC), бактериальных искусственных хромосом (BAC) или человеческих искусственных хромосом (HAC). Искусственная хромосома может нести гораздо больший фрагмент ДНК, чем другие векторы. [9] YAC и BAC могут нести фрагмент ДНК длиной до 300 000 нуклеотидов. Три структурных необходимости искусственной хромосомы включают начало репликации, центромеру и последовательности концевых теломер. [10]

Транскрипция

Транскрипция клонированного гена является необходимым компонентом вектора, когда требуется экспрессия гена: один ген может быть амплифицирован посредством транскрипции для генерации нескольких копий мРНК , шаблона, на котором белок может быть произведен посредством трансляции. [11] Большее количество мРНК будет экспрессировать большее количество белка, и сколько копий мРНК будет сгенерировано, зависит от промотора, используемого в векторе. [12] Экспрессия может быть конститутивной, что означает, что белок производится постоянно в фоновом режиме, или она может быть индуцируемой, когда белок экспрессируется только при определенных условиях, например, при добавлении химического индуктора. Эти два различных типа экспрессии зависят от типов используемых промотора и оператора .

Вирусные промоторы часто используются для конститутивной экспрессии в плазмидах и вирусных векторах, поскольку они обычно надежно вызывают постоянную транскрипцию во многих клеточных линиях и типах. [13] Индуцируемая экспрессия зависит от промоторов, которые реагируют на условия индукции: например, промотор вируса опухоли молочной железы мышей инициирует транскрипцию только после применения дексаметазона , а промотор теплового шока дрозофилы инициирует только после высоких температур.

Некоторые векторы предназначены только для транскрипции, например, для производства мРНК in vitro . Эти векторы называются векторами транскрипции. В них могут отсутствовать последовательности, необходимые для полиаденилирования и терминации, поэтому их нельзя использовать для производства белка.

Выражение

Векторы экспрессии производят белки посредством транскрипции вставки вектора с последующей трансляцией произведенной мРНК , поэтому им требуется больше компонентов, чем более простым векторам, работающим только на транскрипцию. Экспрессия в другом организме-хозяине потребует разных элементов, хотя у них есть схожие требования, например, промотор для инициации транскрипции, сайт связывания рибосомы для инициации трансляции и сигналы терминации.

Вектор экспрессии прокариот

Вектор экспрессии эукариот

Векторам экспрессии эукариот требуются последовательности, которые кодируют:

  • Полиаденилированный хвост : создает полиаденилированный хвост на конце транскрибированной пре-мРНК, который защищает мРНК от экзонуклеаз и обеспечивает терминацию транскрипции и трансляции: стабилизирует продукцию мРНК.
  • Минимальная длина НТК : НТК содержат определенные характеристики, которые могут препятствовать транскрипции или трансляции, поэтому в оптимальных векторах экспрессии кодируются самые короткие НТК или вообще не кодируются.
  • Последовательность Козака : векторы должны кодировать последовательность Козака в мРНК, которая собирает рибосому для трансляции мРНК.

Функции

Современные искусственно созданные векторы содержат основные компоненты, присутствующие во всех векторах, и могут содержать другие дополнительные функции, присутствующие только в некоторых векторах:

  • Точка начала репликации : необходима для репликации и поддержания вектора в клетке-хозяине.
  • Промотор : Промоторы используются для управления транскрипцией трансгена вектора, а также других генов в векторе, таких как ген устойчивости к антибиотикам. Некоторые клонирующие векторы не нуждаются в промоторе для клонированной вставки, но он является важным компонентом векторов экспрессии, чтобы клонированный продукт мог быть выражен.
  • Сайт клонирования: это может быть сайт множественного клонирования или другие особенности, которые позволяют вставлять чужеродную ДНК в вектор посредством лигирования .
  • Генетические маркеры : Генетические маркеры вирусных векторов позволяют подтвердить, что вектор интегрировался с геномной ДНК хозяина.
  • Устойчивость к антибиотикам : векторы с открытыми рамками считывания устойчивости к антибиотикам обеспечивают выживание клеток, поглотивших вектор, в питательной среде, содержащей антибиотики, посредством селекции антибиотиков.
  • Эпитоп : Некоторые векторы могут содержать последовательность для определенного эпитопа, который может быть включен в экспрессируемый белок. Это позволяет проводить идентификацию антителами клеток, экспрессирующих целевой белок.
  • Гены-репортеры : некоторые векторы могут содержать ген-репортер, который позволяет идентифицировать плазмиду, содержащую встроенную последовательность ДНК. Примером является lacZ-α , который кодирует N-концевой фрагмент β-галактозидазы , фермента, который расщепляет галактозу . Множественный сайт клонирования находится внутри lacZ-α , и вставка, успешно лигированная в вектор, нарушит последовательность гена, что приведет к неактивной β-галактозидазе. Клетки, содержащие вектор со вставкой, могут быть идентифицированы с помощью сине-белой селекции путем выращивания клеток в среде, содержащей аналог галактозы ( X-gal ). Клетки, экспрессирующие β-галактозидазу (следовательно, не содержащие вставки), появляются в виде синих колоний. Белые колонии будут отобраны как те, которые могут содержать вставку. Другие часто используемые репортеры включают зеленый флуоресцентный белок и люциферазу .
  • Последовательность нацеливания: Векторы экспрессии могут включать кодирование последовательности нацеливания в готовом белке, которая направляет экспрессированный белок в определенную органеллу в клетке или определенное место, например, в периплазматическое пространство бактерий.
  • Теги очистки белка : некоторые векторы экспрессии включают белки или пептидные последовательности, которые позволяют упростить очистку экспрессируемого белка. Примерами являются полигистидин-тег , глутатион-S-трансфераза и белок, связывающий мальтозу . Некоторые из этих тегов также могут обеспечивать повышенную растворимость целевого белка. Целевой белок сливается с белковым тегом, но сайт расщепления протеазой, расположенный в области полипептидного линкера между белком и тегом, позволяет удалить тег позже.

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ "Vector". Genome.gov . Архивировано из оригинала 2019-07-08 . Получено 2022-04-16 .
  2. ^ Lodish H, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell J (2000). «Клонирование ДНК с помощью плазмидных векторов». Molecular Cell Biology (4-е изд.). Нью-Йорк: WH Freeman. Архивировано из оригинала 27-05-2009 . Получено 11-04-2018 .
  3. ^ Acquaah G (16 августа 2012 г.). Принципы генетики и селекции растений. John Wiley & Sons Inc. ISBN 978-1-118-31369-5.
  4. ^ Johnston C, Martin B, Fichant G, Polard P, Claverys JP (март 2014 г.). «Бактериальная трансформация: распределение, общие механизмы и дивергентный контроль». Nature Reviews. Microbiology . 12 (3): 181–96. doi :10.1038/nrmicro3199. PMID  24509783. S2CID  23559881.
  5. ^ "MeSH Browser". meshb.nlm.nih.gov . Архивировано из оригинала 2018-04-17 . Получено 2018-04-16 .
  6. ^ Hartl DL, Jones EW (1998). Генетика: принципы и анализ (4-е изд.). Садбери, Массачусетс: Jones and Bartlett Publishers. ISBN 978-0-7637-0489-6. OCLC  45730915.
  7. ^ дель Солар, Глория; Хиральдо, Рафаэль; Руис-Эчеваррия, Мария Хесус; Эспиноза, Мануэль; Диас-Орехас, Рамон (июнь 1998 г.). «Репликация и контроль кольцевых бактериальных плазмид». Обзоры микробиологии и молекулярной биологии . 62 (2): 434–464. doi :10.1128/MMBR.62.2.434-464.1998. ISSN  1092-2172. ПМК 98921 . ПМИД  9618448. 
  8. ^ Brown TA (2010). "Глава 2 - Векторы для клонирования генов: плазмиды и бактериофаги". Клонирование генов и анализ ДНК: Введение (6-е изд.). Wiley-Blackwell. ISBN 978-1-4051-8173-0. Архивировано из оригинала 2022-12-17 . Получено 2016-11-07 .
  9. ^ Julin, Douglas (2014). «Искусственные хромосомы». Молекулярные науки о жизни . Springer, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк. стр. 1–3. doi :10.1007/978-1-4614-6436-5_91-3. ISBN 978-1-4614-6436-5.
  10. ^ Мюррей, Эндрю; Шостак, Джек (ноябрь 1987 г.). «Искусственные хромосомы». Scientific American . 257 (5): 62–68. Bibcode : 1987SciAm.257e..62M. doi : 10.1038/scientificamerican1187-62. PMID  3317814.
  11. ^ Solomon EP, Berg LR, Martin DW (2005). Биология (8-е изд.). Belmont, CA: Brooks/Cole Thomson Learning. ISBN 978-0-495-31714-2. OCLC  123008833.
  12. ^ Damdindorj L, Karnan S, Ota A, Hossain E, Konishi Y, Hosokawa Y, Konishi H (2014-08-29). "Сравнительный анализ конститутивных промоторов, расположенных в аденоассоциированных вирусных векторах". PLOS ONE . ​​9 (8): e106472. Bibcode :2014PLoSO...9j6472D. doi : 10.1371/journal.pone.0106472 . PMC 4149579 . PMID  25170953. 
  13. ^ Lewin A, Mayer M, Chusainow J, Jacob D, Appel B (июнь 2005 г.). «Вирусные промоторы могут инициировать экспрессию генов токсинов, введенных в Escherichia coli». BMC Biotechnology . 5 : 19. doi : 10.1186/1472-6750-5-19 . PMC 1181807. PMID  15967027 . 

Дальнейшее чтение

  • Freshney IR (2005-07-29). Культура клеток животных: руководство по базовой технике . Хобокен, Нью-Джерси: John Wiley & Sons, Inc. ISBN 978-0-471-45329-1.
  • Введение в векторы от Waksman Scholars Архивировано 18.01.2008 на Wayback Machine
  • Сравнение векторов, используемых для клинического переноса генов
  • Gene Transport Unit Архивировано 2007-12-06 в Wayback Machine
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Вектор_(молекулярная_биология)&oldid=1227262783"