Очистка нуклеиновых кислот с помощью спин-колонок

Очистка нуклеиновых кислот на основе спин-колонок — это метод твердофазной экстракции для быстрой очистки нуклеиновых кислот . Этот метод основан на том факте, что нуклеиновая кислота будет связываться с твердой фазой силикагеля при определенных условиях.

Различные этапы метода включают лизис, связывание, промывку и элюирование. ^{[1] [2]} Более конкретно, это подразумевает лизис целевых клеток для высвобождения нуклеиновых кислот , селективное связывание нуклеиновой кислоты с кремниевой мембраной, вымывание частиц и ингибиторов, которые не связаны с кремниевой мембраной, и элюирование нуклеиновой кислоты, в результате чего конечным результатом является очищенная нуклеиновая кислота в водном растворе.

Для лизиса клетки (кровь, ткань и т. д.) образца должны пройти обработку, чтобы разрушить клеточную мембрану и освободить нуклеиновую кислоту. В зависимости от целевого материала это может включать использование детергента или других буферов, протеиназ или других ферментов, нагревание до различных времен/температур или механическое разрушение, такое как резка ножом или гомогенизатором , использование ступки и пестика или измельчение с помощью бисерной мельницы.

Для связывания к лизированному образцу затем добавляется буферный раствор вместе с этанолом или изопропанолом . Образец в связывающем растворе затем переносится в спин-колонку, а колонка помещается в центрифугу или присоединяется к вакууму. Центрифуга/вакуум продавливает раствор через кремниевую мембрану, которая находится внутри спин-колонки, где при правильных ионных условиях нуклеиновые кислоты будут связываться с кремниевой мембраной, в то время как остальная часть раствора проходит через нее. После связывания целевого материала поток может быть удален.

Для промывки новый буфер добавляется в колонку, затем центрифугируется/вакуумируется через мембрану. Этот буфер предназначен для поддержания условий связывания, при этом удаляя связывающие соли и другие оставшиеся загрязняющие вещества. Обычно требуется несколько промывок, часто с увеличивающимся процентным содержанием этанола/изопропанола, пока нуклеиновая кислота на кремниевой мембране не освободится от загрязняющих веществ. Последняя «промывка» часто представляет собой сухой этап, позволяющий спирту испариться, оставляя только очищенные нуклеиновые кислоты, связанные с колонкой.

Наконец, элюирование — это процесс добавления водного раствора в колонку, позволяющий гидрофильной нуклеиновой кислоте покинуть колонку и вернуться в раствор. Этот шаг можно улучшить с помощью соли, pH, времени или нагрева. Наконец, для захвата элюата/элюента колонка переносится в чистую микропробирку перед последним шагом центрифугирования.

Еще до методов нуклеиновых кислот, используемых сегодня, было известно, что в присутствии хаотропных агентов , таких как йодид натрия или перхлорат натрия , ДНК связывается с кремнием, частицами стекла или одноклеточными водорослями, называемыми диатомовыми водорослями , которые защищают свои клеточные стенки кремнием . Это свойство использовалось для очистки нуклеиновой кислоты с использованием стеклянного порошка или кремниевых шариков в щелочных условиях. ^[3] Позднее это было улучшено с использованием гуанидинтиоцианата или гуанидингидрохлорида в качестве хаотропного агента. ^[4] Для простоты обращения использование стеклянных шариков позже было заменено на колонки с кремнеземом. А для возможности использования автоматизированных инструментов для экстракции были разработаны покрытые кремнием парамагнитные шарики, более часто называемые экстракцией «магнитными шариками».

• Разделение ДНК методом адсорбции кремния
• Экстракция гуанидиния тиоцианатом-фенолом-хлороформом
• Осаждение этанола
• Очистка ДНК методом SCODA
• Приготовление плазмиды