Экстракция тиоцианата гуанидиния кислоты-фенола-хлороформа

Экстракция тиоцианатом гуанидиния-фенолом-хлороформом (сокращенно AGPC ) — это метод экстракции жидкость-жидкость в биохимии и молекулярной биологии . Он широко используется для выделения РНК (а также ДНК и белка в некоторых случаях). Этот метод может занять больше времени, чем система на основе колонок, такая как очистка на основе кремния, но имеет более высокую чистоту и преимущество в виде высокого извлечения РНК. ^[1] Кроме того, колонка РНК обычно не подходит для очистки коротких (<200 нуклеотидов ) видов РНК, таких как siRNA , miRNA и tRNA .

Первоначально он был разработан Петром Хомчинским и Николеттой Сакки , которые опубликовали свой протокол в 1987 году. ^[2]^[3] Реагент продается компанией Sigma-Aldrich под названием TRI Reagent; компанией Invitrogen под названием TRIzol ; компанией Bioline под названием Trisure; и компанией Tel-Test под названием STAT-60.

Как это работает

Этот метод основан на разделении фаз путем центрифугирования смеси водного образца и раствора, содержащего насыщенный водой фенол и хлороформ , в результате чего получается верхняя водная фаза и нижняя органическая фаза (в основном фенол). Тиоцианат гуанидиния , хаотропный агент , добавляется к органической фазе для содействия денатурации белков (например, тех, которые прочно связывают нуклеиновые кислоты или тех, которые разрушают РНК). Нуклеиновые кислоты ( РНК и/или ДНК ) разделяются в водную фазу, в то время как белок разделяется в органическую фазу. pH смеси определяет, какие нуклеиновые кислоты будут очищены. ^[4] В кислых условиях (pH 4-6) ДНК разделяется в органическую фазу, в то время как РНК остается в водной фазе. В нейтральных условиях (pH 7-8) и ДНК, и РНК разделяются в водную фазу. На последнем этапе нуклеиновые кислоты извлекаются из водной фазы путем осаждения 2-пропанолом . Затем 2-пропанол промывают этанолом , а осадок ненадолго сушат на воздухе и растворяют в буфере TE или воде, свободной от РНКазы.

Тиоцианат гуанидиния денатурирует белки, включая РНКазы, и отделяет рРНК от рибосомальных белков, в то время как фенол , изопропанол и вода являются растворителями с плохой растворимостью. В присутствии хлороформа или BCP (бромхлорпропана) эти растворители полностью разделяются на две фазы, которые распознаются по их цвету: прозрачная верхняя водная фаза (содержащая нуклеиновые кислоты) и нижняя фаза (содержащая белки, растворенные в феноле, и липиды, растворенные в хлороформе). Также могут использоваться другие денатурирующие химикаты, такие как 2-меркаптоэтанол и саркозин . Основным недостатком является то, что фенол и хлороформ являются опасными и неудобными материалами, а экстракция часто трудоемка, поэтому в последние годы многие компании предлагают альтернативные способы выделения РНК.

Реагенты

Фенол : Фенол, используемый для биохимии , поставляется в виде насыщенного водой раствора с буфером Tris , в виде буферного раствора Tris 50% фенола, 50% хлороформа или в виде буферного раствора Tris 50% фенола, 48% хлороформа, 2% изоамилового спирта (иногда называемого «25:24:1»). Фенол от природы несколько растворим в воде и дает размытый интерфейс, который обостряется присутствием хлороформа, а изоамиловый спирт уменьшает пенообразование. Большинство растворов также содержат антиоксидант, поскольку окисленный фенол повреждает нуклеиновые кислоты. Для очистки РНК pH поддерживается на уровне около 4, что удерживает РНК преимущественно в водной фазе. Для очистки ДНК pH обычно около 7, и в этой точке все нуклеиновые кислоты находятся в водной фазе.
Хлороформ : Хлороформ стабилизируется небольшими количествами амилена или этанола , поскольку воздействие чистого хлороформа на кислород и ультрафиолетовый свет приводит к образованию фосгена . Некоторые растворы хлороформа поставляются в виде готовой смеси 96% хлороформа и 4% изоамилового спирта, которую можно смешать с равным объемом фенола для получения раствора 25:24:1.
Изоамиловый спирт : Изоамиловый спирт может уменьшить пенообразование и обеспечить дезактивацию РНКаз.

Смотрите также

Ссылки

^ Рио, Дональд К.; Арес, Мануэль; Хэннон, Грегори Дж.; Нильсен, Тимоти У. (2010). «Очистка РНК с использованием TRIzol (TRI Reagent)». Cold Spring Harbor Protocols . 2010 (6): pdb.prot5439. doi :10.1101/pdb.prot5439. ISSN 1940-3402. PMID 20516177.
^ Chomczynski, P.; Sacchi, N. (1987). «Одношаговый метод выделения РНК с помощью экстракции тиоцианатом гуанидиния-фенолом-хлороформом». Anal. Biochem. 162 (1): 156– 159. doi :10.1016/0003-2697(87)90021-2. PMID 2440339.
^ Chomczynski, P.; Sacchi, N. (2006). «Одношаговый метод выделения РНК с помощью экстракции тиоцианатом гуанидиния-фенолом-хлороформом: двадцать с чем-то лет спустя». Nature Protocols . 1 (2): 581– 585. doi :10.1038/nprot.2006.83. PMID 17406285. S2CID 28653075.
^ Perry RP, La Torre J, Kelley DE, Greenberg JR. (1972) О лабильности последовательностей поли(А) при извлечении матричной РНК из полирибосом. Biochim. Biophys. Acta 262: 220–226; Brawerman G, Mendecki J, Lee SY. (1972) Процедура выделения матричной рибонуклеиновой кислоты млекопитающих. Biochemistry 11: 637–641.

Внешние ссылки

Руководство по реагенту TRI
Протокол на OpenWetWare
Инвитроджен

[z619-1] Рио, Дональд К.; Арес, Мануэль; Хэннон, Грегори Дж.; Нильсен, Тимоти У. (2010). «Очистка РНК с использованием TRIzol (TRI Reagent)». Cold Spring Harbor Protocols . 2010 (6): pdb.prot5439. doi :10.1101/pdb.prot5439. ISSN 1940-3402. PMID 20516177.

[2] Chomczynski, P.; Sacchi, N. (1987). «Одношаговый метод выделения РНК с помощью экстракции тиоцианатом гуанидиния-фенолом-хлороформом». Anal. Biochem. 162 (1): 156– 159. doi :10.1016/0003-2697(87)90021-2. PMID 2440339.

[3] Chomczynski, P.; Sacchi, N. (2006). «Одношаговый метод выделения РНК с помощью экстракции тиоцианатом гуанидиния-фенолом-хлороформом: двадцать с чем-то лет спустя». Nature Protocols . 1 (2): 581– 585. doi :10.1038/nprot.2006.83. PMID 17406285. S2CID 28653075.

[4] Perry RP, La Torre J, Kelley DE, Greenberg JR. (1972) О лабильности последовательностей поли(А) при извлечении матричной РНК из полирибосом. Biochim. Biophys. Acta 262: 220–226; Brawerman G, Mendecki J, Lee SY. (1972) Процедура выделения матричной рибонуклеиновой кислоты млекопитающих. Biochemistry 11: 637–641.