Синхронный коэффициент изменения сопротивления

Синхронный коэффициент изменения сопротивления ( SCODA ) — это биотехнологический метод очистки, разделения и/или концентрирования биомолекул. SCODA обладает способностью разделять молекулы, подвижность (или сопротивление) которых может быть изменена синхронно с движущим полем. Этот метод в основном использовался для концентрирования и очистки ДНК , где подвижность ДНК изменяется с помощью приложенного электрофоретического поля. ^{[1] [2] [3]} Электрофоретический SCODA также был продемонстрирован с РНК и белками .

Как показано ниже, принцип SCODA применим к любой частице, движущейся под действием силового поля, в котором подвижность частицы изменяется синхронно с движущим полем.

Для пояснения рассмотрим электрофоретическую частицу, движущуюся (приводимую в движение) в электрическом поле. Пусть:

${\displaystyle E={\widehat {E}}E_{0}cos(\omega t)}$ (1)

и${\displaystyle dv_{x_{cos2\omega}}}$

${\displaystyle {\overrightarrow {v}}(t)=\mu cos(\omega t){\widehat {E}}E_{0}}$(2)

обозначают электрическое поле и скорость частицы в таком поле. Если постоянна, то среднее по времени значение .${\displaystyle \мю}$${\displaystyle {\overrightarrow {v}}(t)=0}$

Если не является постоянной функцией времени и имеет частотную составляющую, пропорциональную среднему значению по времени, то она не обязательно должна быть равна нулю.${\displaystyle \мю}$${\displaystyle \мю}$${\displaystyle cos(\omega t)}$${\displaystyle {\overrightarrow {v}}(t)}$

Рассмотрим следующий пример:

${\displaystyle \mu (t)=\mu _{0}+\mu _{1}cos(\omega t)}$(3)

Подставляя (3) в (2) и вычисляя среднее по времени, получаем:${\displaystyle {\bar {\overrightarrow {v}}}}$

${\displaystyle {\bar {\overrightarrow {v}}}={\frac {1}{2}}\mu _{1}{\widehat {E}}E_{0}}$(4)

Таким образом, возможно, что частица будет испытывать ненулевую среднюю скорость по времени, другими словами, чистый электрофоретический дрейф, даже если среднее по времени приложенное электрическое поле равно нулю.

Рассмотрим частицу, находящуюся под действием силового поля, имеющую скорость, параллельную направлению поля, и скорость, пропорциональную квадрату величины электрического поля (можно использовать любую другую нелинейность ^[1] ):

${\displaystyle {\overrightarrow {v}}=k{\widehat {E}}(E)^{2}}$(5)

Эффективная подвижность частицы (соотношение между малыми изменениями скорости дрейфа и малыми изменениями электрического поля ) может быть выражена в декартовых координатах как:${\displaystyle d{\overrightarrow {v}}}$${\displaystyle d{\overrightarrow {E}}}$

${\displaystyle dv_{x}={\partial v_{x} \over \partial E_{x}}dE_{x}+{\partial v_{x} \over \partial E_{y}}dE_{y}}$(6)

${\displaystyle dv_{y}={\partial v_{y} \over \partial E_{x}}dE_{x}+{\partial v_{y} \over \partial E_{y}}dE_{y}}$(7)

Объединяя (5), (6) и (7), получаем:

${\displaystyle dv_{x}=k{\Biggl [}{\Biggl (}E+{\frac {E_{x}^{2}}{E}}{\Biggr )}dE_{x}+{\Biggl (}{\frac {E_{x}E_{y}}{E}}{\Biggr )}dE_{y}{\Biggr ]}}$(8)

${\displaystyle dv_{y}=k{\Biggl [}{\Biggl (}{\frac {E_{x}E_{y}}{E}}{\Biggr )}dE_{x}+{\Biggl (}E+{\frac {E_{y}^{2}}{E}}{\Biggr )}dE_{y}{\Biggr ]}}$(9)

Далее рассмотрим поле E, приложенное в плоскости и вращающееся против часовой стрелки с угловой частотой , так что компоненты поля равны:${\displaystyle \omega }$

${\displaystyle E_{x}=Ecos(\omega t)}$(10)

${\displaystyle E_{y}=Esin(\omega t)}$(11)

Подстановка (10) и (11) в (8) и (9) и упрощение с использованием тригонометрических тождеств приводит к сумме постоянных членов, синуса и косинуса, на угловой частоте . Следующие вычисления будут выполнены таким образом, что только косинусные члены на угловой частоте дадут ненулевую чистую скорость дрейфа - поэтому нам нужно оценить только эти члены, которые будут сокращены и . Получается следующее:${\displaystyle 2\omega }$${\displaystyle 2\omega }$${\displaystyle dv_{x_{cos2\omega }}}$${\displaystyle dv_{y_{cos2\omega }}}$

${\displaystyle dv_{x_{cos2\omega }}={\frac {kE}{2}}[cos(2\omega t)]dE_{x}}$(12)

${\displaystyle dv_{y_{cos2\omega }}={\frac {kE}{2}}[cos(2\omega t)]dE_{y}}$(13)

Пусть и принимает форму малого квадрупольного поля напряженности , изменяющегося по синусоидальному закону пропорционально такому, что:${\displaystyle dE_{x}}$${\displaystyle dE_{y}}$${\displaystyle dE_{q}}$${\displaystyle cos(2\omega t)}$

${\displaystyle dE_{x}=-dE_{q}xcos(\omega t)}$(14)

${\displaystyle dE_{y}=dE_{q}ycos(\omega t)}$(15)

Подставляя (14) и (15) в (12) и (13) и взяв среднее по времени, получаем:

${\displaystyle {\bar {dv_{x}}}={\bar {dv_{x_{cos2\omega }}}}=-{\frac {kEdE_{q}}{4}}x}$(16)

${\displaystyle {\bar {dv_{y}}}={\bar {dv_{y_{cos2\omega }}}}=-{\frac {kEdE_{q}}{4}}y}$(17)

что можно суммировать в векторной записи следующим образом:

${\displaystyle {\bar {d{\overrightarrow {v}}}}=-{\frac {kEdE_{q}}{4}}{\overrightarrow {r}}}$(18)

Уравнение (18) показывает, что для всех положений усредненная по времени скорость направлена ​​к началу координат (концентрируя частицы к началу координат), причем скорость пропорциональна коэффициенту подвижности k, напряженности вращающегося поля E и напряженности возмущающего квадрупольного поля .${\displaystyle {\overrightarrow {r}}}$${\displaystyle dE_{q}}$

Молекулы ДНК уникальны тем, что они представляют собой длинные заряженные полимеры, которые в среде разделения, такой как агарозный гель , могут демонстрировать сильно нелинейные профили скорости в ответ на электрическое поле. Таким образом, ДНК легко отделяется от других молекул, которые не являются одновременно заряженными и сильно нелинейными, с помощью SCODA ^[2]

Для выполнения концентрации молекул ДНК методом SCODA образец должен быть внедрен в разделительную среду (гель) в местах, где электрофоретическое поле имеет оптимальную интенсивность. Это начальное перемещение образца в оптимальное положение концентрации называется «инъекцией». Оптимальное положение определяется геометрией геля и расположением управляющих электродов SCODA. Первоначально образец находится в буферном растворе в камере для образца, рядом с концентрационным гелем. Инъекция достигается путем приложения контролируемого электрофоретического поля постоянного тока через камеру для образца, что приводит к переносу всех заряженных частиц в концентрационный гель. Чтобы получить хорошее укладывание образца (т. е. плотную полосу ДНК), можно использовать несколько методов. Одним из примеров является использование соотношения проводимости между буфером камеры для образца и буфером концентрационного геля. Если буфер камеры для образца имеет низкую проводимость, а буфер концентрационного геля имеет высокую проводимость, это приводит к резкому падению электрического поля на границе гель-буфер, что способствует укладке.

После того, как ДНК оптимально расположена в концентрирующем геле, применяются вращающиеся поля SCODA. Частоту полей можно настроить таким образом, чтобы концентрировались только определенные длины ДНК. Для предотвращения кипения на этапе концентрации из-за джоулева нагрева разделительная среда может активно охлаждаться. Также можно изменить фазу полей SCODA, чтобы молекулы были дефокусированы.

Поскольку только частицы, которые демонстрируют нелинейную скорость, испытывают концентрирующую силу SCODA, небольшие заряженные частицы, которые линейно реагируют на электрофоретические поля, не концентрируются. Эти частицы вместо того, чтобы двигаться по спирали к центру геля SCODA, вращаются по орбите с постоянным радиусом. Если на вращающиеся поля SCODA наложить слабое поле постоянного тока, эти частицы будут «смываться» с геля SCODA, в результате чего в центре геля останется высокочистая ДНК.

SCODA DNA force приводит к концентрации образца ДНК в центре геля SCODA. Для извлечения ДНК можно предварительно сформировать в геле лунку для извлечения и заполнить ее буфером. Поскольку ДНК не испытывает нелинейной подвижности в буфере, она накапливается в лунке для извлечения. По окончании этапа концентрирования и очистки образец можно отобрать пипеткой из этой лунки.

Электрофоретическая сила SCODA достаточно мягкая, чтобы сохранить целостность ДНК с высокой молекулярной массой, поскольку она концентрируется к центру геля SCODA. В зависимости от длины ДНК в образце могут использоваться различные протоколы для концентрирования ДНК длиной более 1 Мб.

Концентрация и очистка ДНК были достигнуты непосредственно из образцов битуминозных песков, ресуспендированных в буфере, с использованием техники SCODA. Затем было проведено секвенирование ДНК, и предварительно было идентифицировано более 200 различных бактериальных геномов. ^{[2] [4]} SCODA также использовался для очистки ДНК из многих других источников окружающей среды. ^{[5] [6]}

Нелинейную подвижность ДНК в геле можно дополнительно контролировать путем встраивания в гель SCODA ДНК- олигонуклеотидов, комплементарных фрагментам ДНК в образце. ^{[7] [8]} Это затем приводит к высокоспецифичным нелинейным скоростям для образца ДНК, которые соответствуют ДНК, встроенной в гель. Эта искусственная специфическая нелинейность затем используется для селективной концентрации только интересующих последовательностей, отклоняя все другие последовательности ДНК в образце. Было продемонстрировано более чем 1 000 000-кратное обогащение вариантов отдельных нуклеотидов по сравнению с диким типом.

Применение этого метода – обнаружение редкой опухолевой ДНК ( цДНК ) в образцах крови. ^[9]

• Извлечение ДНК
• Осаждение этанола
• Экстракция фенолом-хлороформом
• Очистка на основе спин-колонки