Микроноситель

Микроноситель — это поддерживающая матрица, которая позволяет выращивать адгезивные клетки в биореакторах . Вместо плоской поверхности клетки культивируются на поверхности сферических микроносителей, так что каждая частица несет несколько сотен клеток, и, следовательно, способность к расширению может быть увеличена в несколько раз. ^[1] Это обеспечивает простой способ масштабирования систем культивирования для промышленного производства клеточной или белковой терапии или для исследовательских целей. ^{[2] [3]}

Эти твердые или пористые сферические матрицы имеют диаметр от 100 до 300 мкм, что обеспечивает достаточную площадь поверхности, сохраняя при этом достаточную адгезию и поддержку клеток, а их плотность минимально превышает плотность воды (1 г/мл), поэтому они остаются во взвешенном состоянии в перемешиваемом резервуаре. ^{[1] [4]} Они могут состоять либо из синтетических материалов, таких как акриламид, либо из натуральных материалов, таких как желатин. ^{[2] [3]}

Преимущества технологии микроносителей в биотехнологической промышленности включают в себя: (a) простоту масштабирования, (b) возможность точного контроля условий роста клеток в сложных биореакторах с компьютерным управлением, (c) общее сокращение площади пола и объема инкубатора, необходимых для производственной операции заданного размера, (d) резкое сокращение труда технического персонала и (e) более естественную среду для культивирования клеток, которая способствует дифференциации. ^[5]

Существует несколько типов микроносителей, которые можно использовать, выбор которых имеет решающее значение для оптимальной производительности для приложения. На раннем этапе развития микроносителей в подавляющем большинстве использовались синтетические материалы, поскольку они позволяли легко контролировать механические свойства и получать воспроизводимые результаты для оценки их производительности. ^[3] К этим материалам относятся ДЭАЭ-декстран, стекло, полистирольный пластик и акриламид . ^[3] В 1967 году разработка микроносителей началась, когда Ван Везель обнаружил, что материал может поддерживать рост клеток, зависящих от прикрепления, и он использовал микроносители диэтиламиноэтил-сефадекс. ^[3] Однако синтетические полимеры препятствуют достаточному взаимодействию клеток с окружающей средой и задерживают их рост. ^[4] Клетки не могут должным образом дифференцироваться без обратной связи со своей средой, а уровни прикрепления будут низкими. ^[3] Поэтому второе поколение разработки микроносителей включает использование природных полимеров, таких как желатин , коллаген , хитин и его производные, а также целлюлоза . ^[2] Эти материалы не только легко получить, но и природные материалы обеспечивают места прикрепления для клеток и подобную микросреду, которая обеспечивает сигнальные пути клеток, необходимые для их правильной дифференциации. ^[3] Кроме того, поскольку они биосовместимы, полученную суспензию можно использовать для доставки клеточной терапии in vivo . ^[1]

Хотя были разработаны жидкие микроносители, подавляющее большинство коммерчески доступных микроносителей представляют собой твердые частицы, синтезированные путем суспензионной полимеризации . ^[3] Однако клетки, выращенные на твердых микроносителях, рискуют быть поврежденными внешними силами и столкновениями с другими частицами и резервуаром. ^[4] Поэтому необходимо принять дополнительные меры предосторожности при определении скорости и механизма перемешивания, чтобы результирующие динамические силы жидкости не были достаточно сильными, чтобы неблагоприятно повлиять на культуру. ^{[4] [3]} Разработка пористых микроносителей значительно расширила возможности этой технологии, поскольку она еще больше увеличила количество клеток, которые может удерживать материал, но, что еще важнее, она защитила клетки внутри частицы от внешних сил. ^[3] К ним относятся силы сопротивления и трения суспензионной жидкости, градиенты давления и напряжения сдвига . ^[1] 1980-е годы были отмечены волной развития микроносителей с прорывом в области пористых частиц. ^[4]

Микроносители из одного и того же материала могут отличаться по своей пористости, удельному весу , оптическим свойствам, наличию компонентов животного происхождения и химии поверхности. ^[4] Химия поверхности может включать белки внеклеточного матрикса, функциональные группы , рекомбинантные белки, пептиды и положительно или отрицательно заряженные молекулы, добавленные посредством конъюгации , сополимеризации , плазменной обработки или прививки. ^[3] Они могут служить для обеспечения более высоких уровней прикрепления клеток к частицам, обеспечивать контролируемое высвобождение для изоляции или делать частицы более термически и физически устойчивыми, среди прочих причин. ^[3]

В продаже имеется несколько типов микроносителей, включая микроносители на основе альгината (GEM, Global Cell Solutions), микроносители на основе декстрана (Cytodex, GE Healthcare ), микроносители на основе коллагена (Cultispher, Percell) и микроносители на основе полистирола (SoloHill Engineering). ^[5]  

Значительным преимуществом использования суспензий на микроносителях для культивирования клеток по сравнению с традиционными двумерными планшетами является их способность удерживать больше клеток в меньших объемах. ^{[1] [6]} Отличительной чертой обычного лабораторного протокола культивирования клеток является непрерывное пассирование , поскольку клетки довольно быстро достигают слияния на планшетах, что является узким местом в производстве биологических препаратов. ^[1] Многослойные сосуды, сложенные планшеты, полые волокна и реакторы с насадочным слоем были другими технологиями, разработанными для борьбы с этим ограничением емкости в культуре клеток на планшетах. ^{[1] [2]} Хотя они были улучшением, количество клеток, полученных с помощью этих методов, все еще не достигало порогового значения для клинического применения. ^[2] Однако культура клеток на микроносителях стала прорывом, необходимым для того, чтобы культура клеток достигла промышленного и клинического значения. ^[2] Исследования показали, что суспензии на микроносителях, по сравнению с культурой в многослойных сосудах, увеличивают выход клеток в 80 раз, занимая всего десять процентов пространства, соответствующего надлежащей производственной практике , и всего шестьдесят процентов от первоначальной стоимости. ^[4] Без необходимости непрерывного пассирования риск бактериального заражения ниже, а затраты на рабочую силу также сведены к минимуму. ^[2]

Двумерная культура также страдает от плохой диффузии питательных веществ и газов, требуя, чтобы добавленные среды и добавки распределялись вручную равномерно, и может привести к невоспроизводимым данным. ^{[1] [2]} Микроносители клеточных суспензий в биореакторах с мешалкой обеспечивают равномерное распределение посредством однородного перемешивания. ^[1] Такие параметры, как pH, давление кислорода и концентрации добавок среды, можно постоянно контролировать внутри биореактора, в отличие от ручного тестирования небольших образцов из пластин. ^[2] Однако высокие скорости перемешивания могут вызывать разрушительные столкновения между частицами и с реактором, а слишком низкая скорость может подавлять рост клеток, вызывая накопление частиц в «мертвой зоне» и препятствуя равномерному распределению необходимых питательных веществ. ^{[1] [4]} Поэтому необходимо рассчитать минимальный и максимальный градиенты скорости, чтобы поддерживать однородность суспензии, но также защищать ее от ненужных сил. ^{[2] [6]} Часто наиболее эффективным механизмом для этого является осевая мешалка внутри биореактора, которая обеспечивает эффективное перемешивание при минимальных скоростях перемешивания. ^[4] Однородная природа хорошо функционирующих биореакторов также позволяет проводить простые процедуры отбора проб и мониторинга по сравнению с двумерной культурой, которая часто страдает от утомительных процедур отбора проб. ^{[4] [2] [6]}

Более того, трехмерная и высокоплотная суспензионная среда способствует естественной морфологии клеток и дифференциации посредством механической стимуляции. ^[1] С другой стороны, двумерная пластинчатая культура имеет тенденцию к дедифференциации клеток в течение нескольких пассажей, и поэтому общее число пассажей должно быть ограничено. ^[1]

Микроносители суспензий также легко масштабируются за счет более высоких концентраций микрочастиц в более крупных реакторах с перемешиванием, в то время как лабораторное пространство, используемое для культивирования, по-прежнему может быть сведено к минимуму. ^[2] Однако масштабирование платформы микроносителей также влечет за собой определенные проблемы в последующем производственном процессе. ^[4] Это включает в себя переработку процессов отсоединения и изоляции клеток. ^[4] Большие объемы суспензионной жидкости необходимо удалять из более крупных ванн биореакторов, и поэтому необходимо закупить больше оборудования для обработки десятков или сотен литров раствора вместо стандартных миллилитров. ^[4]

Микроносители исследуются для доставки клеток для целевой тканевой инженерии. ^[3] Гепатоциты, хондроциты, фибробласты и другие клетки были успешно доставлены с использованием биосовместимых микроносителей к мишеням in vivo для восстановления поврежденных тканей. ^[1] Микроносители также могут использоваться для доставки малых молекул и белков с той же целью. ^[5]

Метод сборки на основе жидкости был разработан П. Ченом и др. для сборки микроносителей, засеянных клетками, в разнообразные структуры. Микроносители, засеянные нейронами, были собраны для формирования трехмерных нейронных сетей с контролируемой глобальной формой. Этот метод потенциально полезен для тканевой инженерии и нейробиологии . ^[7]

• [1]