Открытие и разработка ингибиторов нейраминидазы

Ингибиторы нейраминидазы подавляют ферментативную активность фермента нейраминидазы (сиалидазы). Эти типы ингибиторов были введены в качестве противогриппозных препаратов, поскольку они не дают вирусу покидать инфицированные клетки и, таким образом, останавливают дальнейшее распространение вируса. Ингибиторы нейраминидазы для человеческой нейраминидазы (hNEU) имеют потенциал быть полезными препаратами, поскольку фермент играет роль в нескольких сигнальных путях в клетках и участвует в таких заболеваниях, как диабет и рак . ^[1]

Первые ингибиторы нейраминидазы (NAI) были синтезированы в 1960-х годах Эдмондом и др. ^[2] в попытке понять каталитический механизм фермента нейраминидазы. Они обнаружили, что N-замещенные оксамовые кислоты обладают свойствами ингибиторов фермента. Затем было обнаружено, что синтетическое соединение 2-дезокси-2,3-дидегидро-N-ацетилнейраминовая кислота (Neu5Ac2en или DANA), которое является аналогом N-ацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac), ингибирует высвобождение потомства вируса в культуре тканей, но противовирусной активности у животных обнаружено не было. ^{[3] [4]} В начале 1990-х годов определение биологической кристаллической структуры поверхностного белка вируса гриппа привело к открытию активного центра и предоставило возможности для обнаружения и разработки новых и специфических ингибиторов. ^{[ необходима цитата ]}

Вирус гриппа — это РНК-вирус, который делится на три серологических типа: A, B и C. Гемагглютинин (HA) и нейраминидаза (NA) — два важных гликопротеина на мембранах вируса гриппа. Гемагглютинин — это молекула, связывающая рецептор сиаловой кислоты, и опосредует проникновение вируса в клетку-хозяина, в то время как нейраминидаза расщепляет клеточно-рецепторную сиаловую кислоту, образуя новые частицы. Нейраминидаза — это экзогликозидаза , которая разрушает рецептор гемагглютинина путем расщепления α(2,6)- или α(2,3)-кетозидной связи, которая существует между терминальной сиаловой кислотой и остатком сахара рецептора, содержащего Neu5Ac, на поверхности клеток-хозяев. ^[5] Это способствует распространению инфекции, предотвращая самоагрегацию новых вирусов на поверхности клетки и возможную иммобилизацию в муцине гемагглютинином (ГА) во время репликации вируса. Затем вирус высвобождается из клеток-хозяев и впоследствии заражает другие клетки. ^[6] Нейраминидаза также способствует проникновению вируса в верхние дыхательные пути, возможно, путем расщепления молекул сиаловой кислоты на муцине эпителиальных клеток . Нейраминидаза обнаружена в вирусах гриппа типов A и B. ^[7] Нейраминидаза играет роль в инфицировании, репликации и доставке вируса гриппа A и B. Вирус гриппа типа C экспрессирует фермент эстеразу вместо нейраминидазы. ^[8]

N-ацетилнейраминовая кислота (Neu5Ac) является одной из двух наиболее распространенных сиаловых кислот у млекопитающих. ^[9] Это моносахарид с остовом из 9 атомов углерода. Обычно он присоединяется к гликопротеинам или ганглиозидам на терминальном конце через связи α(2,3), α(2,6) и α(2,8). ^[10] Нейраминидаза — это фермент, который гидролизует эту связь, образуя свободную нейраминовую кислоту и гликопротеин или сахарную цепь. Вирус гриппа будет связываться через белок гемагглютинин с этими прикрепленными к сиаловой кислоте гликопротеинами на клеточной мембране. ^[11]

Было показано, что механизм NA протекает с сохранением конфигурации, что означает, что он сохраняет абсолютную конфигурацию атома в стереоцентре. ^[12] Существует четыре этапа каталитических путей. На первом этапе, этапе связывания, карбоксилатная группа переходит из аксиального положения в псевдоэкваториальное положение. Второй этап - это донорство протона от молекулы воды и образование промежуточного переходного состояния эндоциклического сиалозильного катиона. Третий этап включает нуклеофильную атаку тирозина на сиалозильный катион. Четвертый этап - это образование и высвобождение Neu5Ac. Похожий механизм был предложен Джанакираманом и др. ^[13] , где двойная связь Neu5Ac2en заставляет пиранозу сахарного кольца принимать плоскую структуру, напоминающую структуру переходного состояния.

Существует два типа ингибиторов нейраминидазы, обычно доступных для лечения и профилактики гриппозных инфекций: занамивир и осельтамивир . Они препятствуют высвобождению потомственных вирионов из инфицированных клеток хозяина, предотвращают процесс инфицирования новых клеток хозяина и останавливают распространение инфекции в дыхательных путях, имитируя естественный субстрат и встраиваясь в активный участок фермента нейраминидазы. Они прерывают отсоединение потомственных вирионов. Скорость репликации вируса затем снижается, и это позволяет иммунной системе человека уничтожать оставшиеся вирусы. ^[14]

Нейраминидаза вируса гриппа (vNEU) состоит из 4 копланарных приблизительно сферических субъединиц, в основном состоящих из β-слоев , характеризующихся как 6-кратный β-пропеллер и гидрофобная область, встроенная в мембрану вируса. ^[15] Активный центр расположен около середины псевдосимметричной сферы. Нейраминидаза вируса гриппа расщепляет только терминальные остатки Neu5Ac. Рентгеновская кристаллография показала искаженное полукресло-расположение субстрата Neu5Ac в активном центре. Эта искаженная структура образует сиалозильный катион после высвобождения агликона и затем захватывается в активном центре нуклеофильной атакой остатка тирозина. Ориентация субстрата в активном центре в основном облегчается тремя сохраненными штаммом остатками аргинина, связывающими кислотную группу C1 с солевыми мостиками. Кроме того, активный сайт состоит из восьми других высококонсервативных аминокислотных остатков, которые напрямую контактируют с субстратом или его производными. Включая остаток глутаминовой кислоты, связывающий спиртовые группы C7 и C9 на боковой цепи глицерина (на C6) с водородными связями, и несколько гидрофобных остатков, коррелирующих с метильной группой на C5 N-ацетиле и гидрофобной основной цепи глицерина. ^[16]

Человеческая нейраминидаза (hNEU) имеет много схожих черт с vNEU. В геноме человека есть четыре различных фермента нейраминидазы (NEU1, NEU2, NEU3, NEU4), и только один из них (NEU2) не связан с мембраной или не находится в мембранном комплексе и был изучен с помощью рентгеновской кристаллографии. ^{[1] [17]} Три остатка аргинина, которые связывают кислотную группу C1 с солевыми мостиками в vNEU, также присутствуют в hNEU. Топология активного центра и взаимодействия с субстратом очень похожи, за исключением боковой цепи глицерина, которая предлагает некоторые стратегические возможности при разработке ингибиторов, нацеленных либо на vNEU, либо на hNEU. В hNEU гидроксильные группы глицерина связаны через несколько остатков тирозина , но в vNEU основное взаимодействие происходит с остатком глутаминовой кислоты. Эти общие сходства вызвали опасения относительно потенциальных побочных эффектов от препаратов, нацеленных на vNEU. Тем не менее, большинство хорошо изученных ингибиторов vNEU показали очень малое сродство к hNEU, за исключением препарата от гриппа Занамивир , который является эффективным ингибитором hNEU2. ^{[1] [16]}

2-дезокси-2,3-дидегидро-N-ацетилнейраминовая кислота (Neu5Ac2en) является панселективным ингибитором нейраминидазы. Neu5Ac2en является дегидрированным Neu5Ac и может быть синтезирован ферментом hNEU, если Neu5Ac находится в достаточно высокой концентрации. Neu5Ac также является мягким ингибитором фермента, но поскольку Neu5Ac2en является аналогом переходного состояния, он является гораздо лучшим ингибитором. ^[1]

В начале рентгеновская кристаллография не имела очень хорошего разрешения, поэтому изначально основное внимание уделялось ингибиторам, полученным из субстрата, а не структурно-обоснованным. ^[18] Полученная из Neu5Ac 2-дезокси-α-DN-ацетилнейраминовая кислота (2-дезокси-α-Neu5Ac) была первым использованным шаблоном, а также первым ингибитором, испытанным in vivo на мышиной модели гриппозной инфекции. Незамещенный шаблон показал незначительный эффект. Другой шаблон Neu5Ac2en (DANA) был испытан в тех же условиях и показал хороший эффект in vivo . С появлением новых изображений кристаллической структуры фермента и комплекса Neu5Ac и подтверждением того, что Neu5Ac2en является ингибитором in vivo , основное внимание уделялось созданию производных DANA на основе структуры. С лучшей рентгеновской кристаллической структурой был идентифицирован ряд важных остатков в активном центре, в частности гидроксильная группа C4. Лучший эффект был достигнут путем замены гидроксильной группы C4 на более основную группу, например, аминогруппу. Дальнейший анализ показал, что в активном центре может быть размещена большая группа. 4-амино-4-дезокси-Neu5Ac2en и 4-дезокси-4-гуанидино-Neu5Ac2en были синтезированы и оказались конкурентными ингибиторами вирусной нейраминидазы и значительно ингибировали репликацию как гриппа A, так и гриппа B in vitro и in vivo . 4-дезокси-4-гуанидино-Neu5Ac2en не только показал себя лучшим ингибитором, но и показал значительно более низкое сродство к другим изоформам нейраминидазы. По этим причинам 4-дезокси-4-гуанидино-Neu5Ac2en был выбран в качестве основного кандидата на лекарственное средство под названием Занамивир. Высокая полярная природа и быстрое выведение способствуют низкой биодоступности и быстрому выведению препарата. ^{[6] [16] [19]}

Было синтезировано несколько новых ингибиторов на основе неуглеводных шаблонов. С акцентом на позиционирование двойной связи в ингибиторе, чтобы оно больше напоминало переходное состояние субстрата, и заменой боковой цепи глицерина липофильной группой на основе гидрофобного остова глицерина, взаимодействующего с белком, что привело к открытию GS 4071. GS 4071 основан на циклогексене и имеет 3-пентиловый эфир, который оказался оптимальным, вместо глицерина в качестве боковой цепи. Ингибитор GS 4071 более липофилен, чем его предшественник занамивир, но не обладает большей биодоступностью. Осельтамивир, этиловый эфир GS 4071, был произведен как пролекарство и активно преобразуется в активное лекарство in vivo . ^{[6] [16] [19]}

Перамивир разработан на основе структурного дизайна препарата. После того, как Ямамото и др. сообщили об активности ингибитора NA гриппа α/β-6-ацетил-амино-3,6-дидезокси -D-глицеро-альтро-2-нонулофуранозоновой кислоты ^[20] , производные циклопентана были разработаны с гуанидиногруппой, заменяющей C4-гидроксильное положение DANA в активном центре, подобно Занамивиру. Бабу и др. ^[18] обнаружили, что добавление боковой цепи н-бутила делает соединение более подходящим для гидрофобной области фермента. Однако было обнаружено, что конформация н-бутильной группы отличается при связывании с вирусом гриппа А от ее конформации при связывании с вирусом гриппа В. ^[21] Поскольку соединение обрабатывало аналогичное связывающее взаимодействие с активным центром NA для занамивира и из-за мутации в некоторых штаммах, устойчивых к занамивиру, положение гуанидиновой группы было изменено, а н-бутильная группа была заменена для изменения ее взаимодействия с активным центром. ^{[18] [22]}

Ингибиторы вирусной нейраминидазы в использовании

Занамивир	Осельтамивир	Перамивир	Ланинамивир

_{*Только занамивир и осельтамивир одобрены FDA. Перамивир используется в Японии и Южной Корее. Ланинамивир используется только в Японии. ^[23]}

Были синтезированы новые аналоги ингибиторов НА на основе занамивира, осельтамивира и перамивира с рациональным дизайном лекарственных средств на основе структуры, и их можно разделить на четыре группы.

Аналоги занамивира разработаны для улучшения терапевтического применения. Замена карбоксилатной группы в положении C1 на фосфонатную группу привела к тому, что препарат стал более мощным с высокой степенью сродства к образованию ионного взаимодействия с активным сайтом. Кроме того, реакция клик-химии была использована для синтеза аналога занамивира, модифицированного C4-триазолом, который проявляет ингибирующую активность, близкую к занамивиру. ^[24] Ланинамивир разработан путем замены гидроксильной группы C7 на небольшую липофильную группу, -OCH3 , что привело к превосходной ингибирующей активности. Диол C8 и C9 играет важную роль в связывающей способности с нейраминидазой, продлевая эффект. Полимерные каркасы в положении C7 занамивира через алкиловый эфир привлекли больше внимания, поскольку это показало повышенную противовирусную активность. ^[25]

Аналоги Занамивира

C4-тризол	4-аминофосфоно-ДАНА
Фосфоно-занамивир	Пролекарство фосфоно-занамивира

Знание структуры переходного состояния было использовано для разработки аналогов осельтамивира. Например, триазолсодержащие карбоциклы группы фон Ицштейна и Пинто и фосфонатный аналог осельтамивира, как сообщается, демонстрируют более сильную активность в результате соответствующего способа связывания фосфоната с тремя остатками аргинина в активном центре. ^[26]

Аналоги осельтамивира

Триазолсодержащие карбоциклические аналоги	Аналог фосфоната. R 1 , R 2 = -H или -CH2CH3

,

Перамивир — производное циклопентана, разработанное с гуанидиногруппой, заменяющей гидроксильную группу C-4 Neu5Ac2en в активном центре, с отрицательно заряженной карбоксилатной группой и боковой цепью н-бутила. 1-этилпропиламидная, диэтиламидная, дипропиламидная и 4-морфолиниламидная группы показали превосходную ингибирующую активность. Изменение циклопентанового кольца на пирролидиновое также показало высокую ингибирующую активность. ^[27]

Аналоги перамивира

Замена дигидропиранового кольца на бензольное кольцо увеличивает липофильность препарата и делает его намного более стабильным и более доступным для синтеза. На основе взаимодействия DANA и NA были синтезированы бензойные производные. Они показали схожую или лучшую ингибирующую активность по сравнению с Neu5Ac. ^[26]

Аналоги бензойной кислоты

Занамивир и Осельтамивир были протестированы в качестве ингибиторов hNEU. Только занамивир проявляет умеренную ингибирующую активность в отношении hNEU. Селективные ингибиторы изоферментов могут быть потенциально очень важны. В настоящее время существует ограниченное количество исследований субстратной специфичности hNEU. DANA является панселективным ингибитором для всех изоферментов hNEU с разницей в активности ингибирования от 2 до 10 раз, наиболее эффективным для hNEU3 и hNEU4. В нескольких отчетах производные DANA были протестированы в качестве ингибиторов для hNEU2 и hNEU3. Большинство производных показали сниженное ингибирование in vitro . Однако производное N5-азидоацетат-C9-азидо DANA показало улучшенное ингибирование для hNEU2 и hNEU3. Эти исследования пришли к выводу, что активный сайт в ферментах может переносить большие модификации в C9 лучше, чем в N5. ^[1] Тестирование производных C9 амидо DANA показало наличие селективных ингибиторов hNEU1. Эти соединения показали большую активность, чем DANA, и только незначительную активность для hNEU3 с примерно 25-кратной селективностью для hNEU1. Эти исследования показывают, что карман боковой цепи глицерина в активном центре потенциально может быть изменен при разработке селективных ингибиторов изофермента для hNEU. Сообщалось о комбинации модифицированных производных DANA C4 и C7 с умеренной селективностью для hNEU2 и hNEU3. ^[28] Наконец, сообщалось о производных C9-триазола DANA, содержащих алкоксигруппу с наномолярной активностью против изофермента hNEU4. С 500-кратной селективностью для hNEU4 это самая высокая зарегистрированная селективность для изофермента hNEU на сегодняшний день. ^[1]

Существуют 2 подгруппы ингибиторов NA, одобренные регулирующими органами в США и Европе: занамивир и осельтамивир. Оба предназначены для лечения и профилактики гриппа. Кроме того, перамивир и ланинамивир были одобрены регулирующими органами в некоторых частях Азии. ^[23]

Ланинамивир одобрен для лечения гриппа под торговым названием Инавир в Японии, но он все еще находится на стадии клинических испытаний в США. ^[29] Ланинамивир — это ингаляционный препарат длительного действия, назначаемый в виде пролекарства (октаноат ланинамивира). Ланинамивир назначается в виде однократной дозы и остается активным в течение как минимум 5 дней и до 7 дней. ^{[30] [31]}

Осельтамивир можно найти под такими торговыми наименованиями, как Agucort®, Antiflu, Fluvir, Fluhalt, GPO-A-Flu™, Omiflu, Rimivat, Virobin, Oseltamivir и Tamiflu®. ^[32] Осельтамивир используется для пациентов в возрасте от 1 года и старше. Он дается в виде одной дозы два раза в день для лечения гриппа. Для профилактики гриппа осельтамивир дается в виде одной дозы один раз в день в течение как минимум 10 дней после контакта с инфицированным человеком и до шести месяцев (во время эпидемии гриппа). Наиболее распространенными побочными эффектами осельтамивира являются головная боль и тошнота (у взрослых), а также рвота, кашель и заложенность носа (у детей). ^[33]

Перамивир одобрен для лечения гриппа под торговыми наименованиями Rapiacta® в Японии и Peramiflu в Южной Корее. ^[34] В США и других странах перамивир проходит позднюю фазу клинических испытаний. Перамивир используется внутривенно и использовался при неотложном лечении H1N1 2009 года у отдельных пациентов. ^{[30] [35]}

Занамивир можно найти под такими торговыми наименованиями, как Relenza™, Verenza и Z-Flu DPI. ^[36] Занамивир используется для пациентов в возрасте от 5 лет и старше. Он назначается в дозе 10 мг два раза в день для лечения гриппа. Для профилактики гриппа занамивир назначается в дозе 10 мг один раз в день в течение 10 дней после контакта с инфицированным человеком или в течение 28 дней (во время эпидемии гриппа). Сообщается, что наиболее распространенным побочным эффектом занамивира является сыпь. ^[37]

В настоящее время существует два класса противовирусных препаратов, одобренных для лечения и профилактики гриппозных инфекций. Это адамантаны и ингибиторы нейраминидазы. Адамантаны действуют только на грипп А, поэтому с 2010 года ВОЗ рекомендовала использовать ингибиторы нейраминидазы для лечения и профилактики гриппозных инфекций А и В. ^[38] В отличие от адамантанов, ингибиторы нейраминидазы менее токсичны и менее склонны способствовать развитию лекарственно-устойчивого гриппа. Более того, они эффективны против всех подтипов нейраминидазы и всех штаммов гриппа. После пандемии гриппа в 2009 году возникла большая обеспокоенность по поводу вирусной резистентности к ингибиторам нейраминидазы. ^{[30] [38] [39]} Вирусы гриппа, которые имеют сниженную чувствительность к ингибиторам нейраминидазы, часто содержат мутацию, которая влияет на форму каталитического сайта NA и, следовательно, снижает связывающую способность ингибиторов. Каталитический сайт NA имеет восемь функциональных остатков (R118, D151, R152, R224, E276, R292, R371 и Y406), окруженных одиннадцатью каркасными остатками (E119, R156, W178, S179, D198, I222, E227, H274, E277, N294 и E425). ^[38]

Осельтамивир имеет большую гидрофобную боковую цепь, и NA должен подвергнуться перестройке, чтобы сформировать карман для связывания препарата путем вращения аминокислоты E276 и связи с R224. Мутации, такие как H274Y, R292K и N294S, которые влияют на это формирование, могут снизить эффективность ингибитора. ^[38]

Устойчивость к занамивиру была низкой как для сезонных, так и для пандемических вирусов по сравнению с осельтамивиром. Молекулярная структура занамивира имеет гуанидиновую группу, эта группа взаимодействует с остатком E119 в кармане активного центра. Устойчивость к занамивиру может быть вызвана мутациями, которые влияют на связывающее сродство между ферментом и ингибитором. Было показано, что мутация в остатке E119 снижает эффективность ингибиторов in vitro . ^[38]

Перамивир имеет гуанидиногруппу, похожую на занамивир, и гидрофобную группу, похожую на осельтамивир. Мутации, которые влияют на эффективность осельтамивира и занамивира, также могут влиять на эффективность перамивира. Устойчивость к перамивиру была замечена при мутации остатка H274Y in vitro . Одна из этих резистентностей связана с перекрестной резистентностью к перамивиру и осельтамивиру. ^[38] Перамивир одобрен в Японии как Rapiacta и также доступен в Южной Корее как Peramiflu. ^[23]

Не сообщалось о резистентности к ланинамивиру. Однако есть опасения, что резистентность к ланинамивиру аналогична резистентности к занамивиру из-за сходства в связывающих свойствах с белком NA. ^[38] Октаноат ланинамивира (CS-8958), который является пролекарством ланинамивира (еще один ингаляционный NAI с длительно действующими свойствами), также был одобрен в Японии и коммерчески доступен под названием Инавир (Daiichi Sankyo Company Ltd. ^[23]

Нейраминидаза
Ингибиторы нейраминидазы
Вирус гриппа
Адамантан