Вольтамперометрия белковой пленки
Метод химического анализа

В электрохимии вольтамперометрия белковой пленки (или электрохимия белковой пленки , или прямая электрохимия белков ) — это метод исследования поведения белков, иммобилизованных ( адсорбированных или ковалентно присоединенных) на электроде . Метод применим к белкам и ферментам , которые участвуют в реакциях переноса электронов , и является частью методов, доступных для изучения кинетики ферментов . [ требуется ссылка ]

При условии, что он имеет подходящий контакт с поверхностью электрода (перенос электронов между электродом и белком происходит напрямую) и при условии, что он не денатурирован , белок можно плодотворно исследовать, контролируя ток как функцию потенциала электрода и других экспериментальных параметров.

Могут использоваться различные материалы для электродов. [1] Для работы с мембраносвязанными белками требуются специальные конструкции электродов. [2]

Эксперименты с окислительно-восстановительными белками

Малые окислительно-восстановительные белки, такие как цитохромы и ферредоксины, могут быть исследованы при условии, что их электроактивное покрытие (количество белка, подвергающегося прямому переносу электронов) достаточно велико (на практике больше, чем доля пмоль/см 2 ).

Электрохимические данные, полученные с помощью небольших белков, можно использовать для измерения окислительно-восстановительных потенциалов окислительно-восстановительных участков белка [3], скорости переноса электронов между белком и электродом [4] или скорости химических реакций (таких как протонирование), которые связаны с переносом электронов [5] .

Интерпретация пикового тока и пиковой площади

Рис. 1. Вольтамперометрические сигналы для одноэлектронного (A) или двухэлектронного (B) редокс-вида, адсорбированного на электроде в пределе медленной скорости сканирования. Ток, изображенный здесь, нормализован по , что подразумевает, что измеренный ток увеличивается пропорционально скорости сканирования ( ). Ф 2 ν А Г / Р Т {\displaystyle F^{2}\nu A\Gamma /RT} ν {\displaystyle \nu}
Рис. 2. Влияние скорости сканирования на вольтамперометрию одноэлектронного окислительно-восстановительного вещества, адсорбированного на электроде (ток, показанный здесь, нормализован по , что подразумевает, что измеренный ток увеличивается пропорционально скорости сканирования ( )), рассчитанной для , К. Скорость сканирования увеличивается от синего к красному. A: вольтамперограммы. B: пиковые потенциалы Ф 2 ν А Г / Р Т {\displaystyle F^{2}\nu A\Gamma /RT} ν {\displaystyle \nu} α = 0,5 {\displaystyle \альфа =0,5} Т = 298 {\displaystyle Т=298}

В эксперименте по циклической вольтамперометрии, проведенном с адсорбированным редокс-белком, окисление и восстановление каждого редокс-сайта отображается в виде пары положительных и отрицательных пиков. Поскольку весь образец окисляется или восстанавливается во время развертки потенциала, пиковый ток и площадь пика должны быть пропорциональны скорости сканирования (наблюдение того, что пиковый ток пропорционален скорости сканирования, доказывает, что редокс-вид, дающий пик, фактически иммобилизован). [3] То же самое справедливо для экспериментов, проведенных с небиологическими редокс-молекулами, адсорбированными на электродах. Теория была в основном разработана французским электрохимиком Этьеном Лавироном в 1980-х годах [4] , [6] , . [7]

Поскольку и этот фарадеевский ток (который возникает в результате окисления/восстановления адсорбированной молекулы), и емкостный ток (который возникает в результате зарядки электрода) увеличиваются пропорционально скорости сканирования, пики должны оставаться видимыми при увеличении скорости сканирования. Напротив, когда окислительно-восстановительный аналит находится в растворе и диффундирует к/от электрода, пиковый ток пропорционален квадратному корню скорости сканирования (см.: уравнение Рэндлса–Севчика ).

Площадь пика

Независимо от скорости сканирования площадь под пиком (в единицах AV) равна , где - число электронов, обмененных при окислении/восстановлении центра, - поверхность электрода, а - электроактивное покрытие (в единицах моль/см 2 ). [3] Последнее, следовательно, можно вывести из площади под пиком после вычитания емкостного тока. н Ф А Г ν {\displaystyle nFA\Gamma \nu } н {\displaystyle n} А {\displaystyle А} Г {\displaystyle \Гамма}

Форма пика

Низкая скорость сканирования

При низкой скорости сканирования не должно быть разделения между окислительными и восстановительными пиками.

  • Одноэлектронный сайт (например, гем или кластер FeS) дает широкий пик (рис. 1A). Уравнение, которое дает форму и интенсивность пика, следующее:
я Ф 2 ν А Г / Р Т = ± эксп ⁡ ( Ф Р Т ( Э − Э 0 ) ) ( 1 + эксп ⁡ ( Ф Р Т ( Э − Э 0 ) ) 2 {\displaystyle {\frac {i}{F^{2}\nu A\Gamma /RT}}=\pm {\frac {\exp \left({\frac {F}{RT}}(EE^{0})\right)}{(1+\exp \left({\frac {F}{RT}}(EE^{0})\right)^{2}}}}
В идеале пиковое положение находится в обоих направлениях. Пиковый ток равен (он пропорционален скорости сканирования, , и количеству окислительно-восстановительных участков на электроде, ). Идеальная полуширина на полувысоте (HWHH) равна мВ при 20 °C. Неидеальное поведение может привести к тому, что пик будет шире идеального предела. Э п = Э 0 {\displaystyle E_{p}=E^{0}} я п = Ф 2 ν А Г / 4 Р Т {\displaystyle i_{p}=F^{2}\nu A\Gamma /4RT} ν {\displaystyle \nu} А Г {\displaystyle A\Гамма} Р Т / Ф × вн ⁡ ( 3 + 2 2 ) = 89 {\displaystyle RT/F\times \ln(3+2{\sqrt {2}})=89}
  • Форма пика для двухэлектронного окислительно-восстановительного участка (например, флавина ) зависит от стабильности полувосстановленного состояния (рис. 1B). Если полувосстановленное состояние стабильно в широком диапазоне электродного потенциала, сигнал представляет собой сумму двух одноэлектронных пиков (фиолетовая линия на рис. 1B). Если полувосстановленное состояние нестабильно, сигнал представляет собой один пик (красная линия на рис. 1B), который может иметь высоту до четырех раз больше и ширину в два раза меньше одноэлектронного пика. [6] , [8]
  • Белок, содержащий несколько окислительно-восстановительных центров, должен давать несколько пиков, имеющих одинаковую площадь (масштабируется по ). н {\displaystyle n}
Высокая скорость сканирования

Если реакция представляет собой простую реакцию переноса электронов, пики должны оставаться симметричными при высоких скоростях сканирования. Разделение пиков наблюдается при скорости сканирования , где — константа скорости обмена электронов в теории Батлера-Фольмера . Уравнение Лавирона [4] , [8] , [9] предсказывает, что при высоких скоростях сканирования пики разделяются пропорционально . Чем больше или меньше , тем больше разделение пиков. Потенциалы пиков равны , [4] как показано линиями на рис. 2B ( — коэффициент переноса заряда ). Таким образом, изучение экспериментального изменения положения пика в зависимости от скорости сканирования дает информацию о скорости межфазного переноса электронов . ν ≫ Р Т к 0 / Ф {\displaystyle \nu \gg RTk^{0}/F} к 0 {\displaystyle k_{0}} бревно ⁡ ( ν / к 0 ) {\displaystyle \log(\nu /k^{0})} ν {\displaystyle \nu} к 0 {\displaystyle к^{0}} Э п = Э 0 ± Р Т α Ф вн ⁡ α Ф ν к 0 Р Т {\displaystyle E_{p}=E^{0}\pm {\frac {RT}{\alpha F}}\ln {\frac {\alpha F\nu }{k^{0}RT}}} α {\displaystyle \альфа} к 0 {\displaystyle к^{0}}

Эффект сопряженных химических реакций

Сопряженные реакции — это реакции, скорость или константа равновесия которых не одинаковы для окисленных и восстановленных форм исследуемого вида. Например, восстановление должно благоприятствовать протонированию ( ): реакция протонирования сопряжена с восстановлением при . Связывание небольшой молекулы (отличной от протона) также может быть сопряжено с окислительно-восстановительной реакцией. п К а о х < п К а г е г {\displaystyle pK_{a}^{\rm {ox}}<pK_{a}^{\rm {red}}} п К а о х < п ЧАС < п К а г е г {\displaystyle pK_{a}^{\rm {ox}}<pH<pK_{a}^{\rm {red}}}

Необходимо рассмотреть два случая в зависимости от того, является ли сопряженная реакция медленной или быстрой (это означает, что временной масштаб сопряженной реакции больше или меньше вольтамперометрического временного масштаба [10] ). τ = Р Т / Ф ν {\displaystyle \tau =RT/F\nu }

  • Быстрые химические реакции, сопряженные с переносом электронов (например, протонирование), влияют только на кажущиеся значения и , [7], но пики остаются симметричными. Зависимость от концентрации лиганда (например, зависимость от pH, изображенная на диаграмме Пурбэ ) можно интерпретировать для получения констант диссоциации (например, констант кислотности ) из окисленных или восстановленных форм окислительно-восстановительных видов. Э 0 {\displaystyle E^{0}} к 0 {\displaystyle к^{0}} Э 0 {\displaystyle E^{0}} Э 0 {\displaystyle E^{0}}
  • Асимметрия может быть результатом медленных химических реакций, которые связаны с переносом электронов (и управляют им ). Из быстрой сканирующей вольтамперометрии можно получить информацию о скоростях реакций , связанных с переносом электронов. Случай обратимых поверхностных электрохимических реакций, за которыми следуют необратимые химические реакции, был рассмотрен Лавироном в работах [6] , [11], но данные обычно интерпретируются с использованием численного решения соответствующих дифференциальных уравнений. [9] н = 1 {\displaystyle n=1} н = 2 {\displaystyle n=2}

Эксперименты с окислительно-восстановительными ферментами

При изучении ферментов ток возникает в результате каталитического окисления или восстановления субстрата фермента .

Электроактивное покрытие крупных окислительно-восстановительных ферментов (таких как лакказа , гидрогеназа и т. д.) часто слишком мало, чтобы обнаружить какой-либо сигнал в отсутствие субстрата, но электрохимический сигнал усиливается катализом: действительно, каталитический ток пропорционален скорости оборота, умноженной на электроактивное покрытие. Эффект изменения электродного потенциала, pH или концентрации субстратов и ингибиторов и т. д. можно исследовать, чтобы узнать о различных этапах каталитического механизма. [8]

Интерпретация значения каталитического тока

Для фермента, иммобилизованного на электроде, значение тока при определенном потенциале равно , где - число электронов, обмениваемых в каталитической реакции, - поверхность электрода, - электроактивное покрытие, а TOF - частота оборота (или "число оборотов") , то есть число молекул субстрата, преобразуемых в секунду и на молекулу адсорбированного фермента). Последнее можно вывести из абсолютного значения тока только при условии, что оно известно, что бывает редко. Однако информация получается путем анализа относительного изменения тока, которое возникает в результате изменения экспериментальных условий. ± н Ф А Г × Т О Ф {\displaystyle \pm nFA\Gamma \times {\rm {TOF}}} н {\displaystyle n} А {\displaystyle А} Г {\displaystyle \Гамма} А Г {\displaystyle A\Гамма}

Факторами, которые могут влиять на TOF, являются (i) массовый перенос субстрата к электроду, где иммобилизован фермент ( диффузия и конвекция ), (ii) скорость переноса электронов между электродом и ферментом (межфазный перенос электронов) и (iii) «внутренняя» активность фермента, все из которых могут зависеть от потенциала электрода.

Фермент часто иммобилизуется на вращающемся дисковом рабочем электроде (RDE), который быстро вращается, чтобы предотвратить истощение субстрата вблизи электрода. В этом случае массовый перенос субстрата к электроду, где адсорбируется фермент, может не иметь значения.

Стационарный вольтамперометрический отклик

В очень окислительных или очень восстановительных условиях стационарный каталитический ток иногда стремится к предельному значению (плато), которое (при условии отсутствия ограничения массопереноса) относится к активности полностью окисленного или полностью восстановленного фермента соответственно. Если межфазный перенос электронов медленный и если существует распределение скоростей переноса электронов (в результате распределения ориентаций молекул ферментов на электроде), ток продолжает линейно расти с потенциалом вместо того, чтобы достичь плато; в этом случае предельный наклон пропорционален скорости оборота полностью окисленного или полностью восстановленного фермента. [8]

Изменение установившегося тока в зависимости от потенциала часто является сложным (например, не просто сигмоидальным) [12] .

Отклонение от устойчивого состояния

Другой уровень сложности возникает из-за существования медленных окислительно-восстановительных реакций, которые могут изменить активность фермента и заставить реакцию отойти от стационарного состояния. [13] Здесь, медленный означает, что временная шкала (не)активации похожа на вольтамперометрическую временную шкалу [10] . Если используется RDE , эти медленные (не)активации обнаруживаются по гистерезису в каталитической вольтамперограмме, который не обусловлен массопереносом. Гистерезис может исчезнуть при очень высоких скоростях сканирования (если инактивация не успевает произойти) или при очень низких скоростях сканирования (если реакция (не)активации достигает стационарного состояния). [14] τ = Р Т / Ф ν {\displaystyle \tau =RT/F\nu }

Сочетание вольтамперометрии белковой пленки и спектроскопии

Обычная вольтамперометрия дает ограниченную картину интерфейса фермент-электрод и структуры видов, участвующих в реакции. Дополнение стандартной электрохимии другими методами может дать более полную картину катализа. [15] [16] [17]

Ссылки

  1. ^ Jeuken, Lars JC (2016). "Структура и модификация электродных материалов для белковой электрохимии". Биофотоэлектрохимия: от биоэлектрохимии к биофотовольтаике . Достижения в области биохимической инженерии/биотехнологии. Т. 158. Springer, Cham. стр. 43–73. doi :10.1007/10_2015_5011. ISBN 9783319506654. PMID  27506830.
  2. ^ Jeuken, Lars JC (2009-09-23). ​​"Электроды для интегральных мембранных ферментов". Natural Product Reports . 26 (10): 1234–40. doi :10.1039/b903252e. ISSN  1460-4752. PMID  19779638.
  3. ^ abc Бард, Аллен Дж. (2001). Электрохимические методы: основы и применение . Фолкнер, Ларри Р., 1944- (2-е изд.). Нью-Йорк: Wiley. ISBN 9780471043720. OCLC  43859504.
  4. ^ abcd Laviron, E. (1979). "Общее выражение линейной вольтамперограммы развертки потенциала в случае бездиффузионных электрохимических систем". Журнал электроаналитической химии и межфазной электрохимии . 101 (1): 19–28. doi :10.1016/s0022-0728(79)80075-3.
  5. ^ Чен, Кайшэн; Хёрст, Джуди; Камба, Рауль; Бонагура, Кристофер А.; Стаут, К. Дэвид; Берджесс, Барбара. К.; Армстронг, Фрейзер А. (2000-06-15). «Атомно определенный механизм переноса протона в скрытый окислительно-восстановительный центр в белке». Nature . 405 (6788): 814–817. Bibcode :2000Natur.405..814C. doi :10.1038/35015610. ISSN  1476-4687. PMID  10866206. S2CID  4303347.
  6. ^ abc Plichon, V.; Laviron, E. (1976). «Теоретическое исследование двухшаговой обратимой электрохимической реакции, связанной с необратимыми химическими реакциями в линейной вольтамперометрии с разверткой потенциала в тонком слое». Журнал электроаналитической химии и межфазной электрохимии . 71 (2): 143–156. doi :10.1016/s0022-0728(76)80030-7.
  7. ^ ab Laviron, E. (1980). «Теоретическое исследование электрохимической реакции на поверхности 1e, 1H+ (четырехчленная квадратная схема), когда реакции протонирования находятся в равновесии». Журнал электроаналитической химии и межфазной электрохимии . 109 (1–3): 57–67. doi :10.1016/s0022-0728(80)80106-9.
  8. ^ abcd Леже, Кристоф; Бертран, Патрик (2008-07-01). "Прямая электрохимия окислительно-восстановительных ферментов как инструмент для механистических исследований" (PDF) . Chemical Reviews . 108 (7): 2379–2438. doi : 10.1021/cr0680742 . ISSN  0009-2665. PMID  18620368.
  9. ^ ab Armstrong, Fraser A.; Camba, Raúl; Heering, Hendrik A.; Hirst, Judy; Jeuken, Lars JC; Jones, Anne K.; Le′ger, Christophe; McEvoy, James P. (2000-01-01). "Быстрые вольтамперометрические исследования кинетики и энергетики сопряженных реакций переноса электронов в белках". Faraday Discussions . 116 (116): 191–203. Bibcode : 2000FaDi..116..191A. doi : 10.1039/b002290j. ISSN  1364-5498. PMID  11197478.
  10. ^ ab Savéant, Jean-Michel (2006), Elements of Molecular and Biomolecular Electrochemistry: An Electrochemical Approach to Electron Transfer Chemistry , John Wiley & Sons , стр. 455, doi :10.1002/0471758078, ISBN 978-0-471-44573-9
  11. ^ Лавирон, Э. (1972). «Влияние адсорбции деполяризатора или продукта электрохимической реакции на полярографические токи». Журнал электроаналитической химии и межфазной электрохимии . 35 (1): 333–342. doi :10.1016/s0022-0728(72)80318-8.
  12. ^ Эллиотт, Шон Дж.; Леже, Кристоф; Першад, Харш Р.; Хирст, Джуди; Хеффрон, Керенса; Жине, Николя; Бласко, Фрэнсис; Ротери, Ричард А.; Вайнер, Джоэл Х.; Армстронг, Фрейзер (2002). «Обнаружение и интерпретация оптимумов окислительно-восстановительного потенциала в каталитической активности ферментов». Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Биоэнергетика . 1555 (1–3): 54–59. doi : 10.1016/s0005-2728(02)00254-2 . PMID  12206891.
  13. ^ Фурмонд, Винсент; Леже, Кристоф (2017). «Моделирование вольтамперометрии адсорбированных ферментов и молекулярных катализаторов» (PDF) . Current Opinion in Electrochemistry . 1 (1): 110–120. doi :10.1016/j.coelec.2016.11.002.
  14. ^ дель Баррио, Мелиса; Сенси, Маттео; Орейн, Кристоф; Бафферт, Кэрол; Дементин, Себастьен; Фурмонд, Венсан; Леже, Кристоф (2018). «Электрохимические исследования гидрогеназ и других ферментов, которые производят и используют солнечное топливо» (PDF) . Accounts of Chemical Research . 51 (3): 769–777. doi :10.1021/acs.accounts.7b00622. ISSN  0001-4842. PMID  29517230. S2CID  3803863.
  15. ^ Мургида, Дэниел Х.; Хильдебрандт, Питер (2005). «Окислительно-восстановительные и окислительно-восстановительные процессы гем-протеинов и ферментов на электрохимических интерфейсах». Физическая химия Химическая физика . 7 (22): 3773–84. Bibcode :2005PCCP....7.3773M. doi :10.1039/b507989f. ISSN  1463-9084. PMID  16358026.
  16. ^ Эш, Филип А.; Винсент, Кайли А. (2016). Биофотоэлектрохимия: от биоэлектрохимии к биофотовольтаике . Достижения в области биохимической инженерии/биотехнологии. Т. 158. Springer, Cham. стр. 75–110. doi :10.1007/10_2016_3. ISBN 9783319506654. PMID  27475648.
  17. ^ Корниенко, Николай; Ли, Хоа Х.; Робинсон, Уильям Э.; Хайдари, Нина; Чжан, Дженни З.; Рейснер, Эрвин (1 мая 2019 г.). «Усовершенствованные методы исследования интерфейса фермент–электрод». Accounts of Chemical Research . 52 (5): 1439–1448. doi :10.1021/acs.accounts.9b00087. ISSN  0001-4842. PMC 6533600. PMID 31042353  . 
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Вольтамперометрия_белковой_пленки&oldid=1179767788"