Зимография
Зимография — это электрофоретический метод обнаружения гидролитических ферментов , основанный на субстратном репертуаре фермента. Используются три типа зимографии: зимография в геле , зимография in situ и зимография in vivo . [2] Например, желатин, заключенный в полиакриламидный гель, будет переварен активными желатиназами, прошедшими через гель. После окрашивания Кумасси области деградации видны как четкие полосы на темном окрашенном фоне. [3]
Современное использование термина зимография было адаптировано для определения изучения и каталогизации ферментированных продуктов, таких как пиво или вино, часто определенными пивоварами или виноделами или в рамках определенной категории ферментации, например, с определенным штаммом дрожжей или видом бактерий. [ необходима цитата ] Зимография также относится к коллекции связанных ферментированных продуктов, рассматриваемых как совокупность работ. Например, все сорта пива, произведенные определенной пивоварней, могут быть коллективно названы ее зимографией. [ необходима цитата ]
См. также Зимология или прикладная наука зимография. Зимология относится к биохимическим процессам ферментации, особенно к выбору ферментирующих дрожжей и бактерий в пивоварении, виноделии и других ферментированных продуктах. Например, производство пива включает применение дрожжей верхнего (эль) или низового брожения (лагер) для получения желаемого сорта пива. Синтез дрожжей может влиять на вкусовой профиль пива, т. е. диацетил (вкус или аромат масла, ирисок).
Гель-зимография
Образцы готовятся в стандартном невосстанавливающем загрузочном буфере для SDS-PAGE . Восстанавливающий агент или кипячение не требуются, поскольку они могут помешать повторному сворачиванию фермента. Подходящий субстрат (например, желатин или казеин для обнаружения протеазы) встраивается в разрешающий гель во время приготовления акриламидного геля . После электрофореза SDS удаляется из геля (или зимограммы ) путем инкубации в небуферизованном Triton X-100 , а затем инкубации в соответствующем буфере для пищеварения в течение оптимизированного периода времени при температуре 37 °C. Затем зимограмма окрашивается (обычно амидо черным или кумасси бриллиантовым синим ), и области пищеварения появляются в виде четких полос на темно-окрашенном фоне, где субстрат был разложен ферментом.
Вариации стандартного протокола
Стандартный протокол может потребовать изменений в зависимости от фермента образца; например, пищеварительные гликозидазы D. melanogaster обычно выживают в восстановительных условиях (т. е. в присутствии 2-меркаптоэтанола или DTT ) и в некоторой степени при нагревании. Действительно, разделения после нагревания до 50 °C, как правило, демонстрируют существенное увеличение разрешения полос без заметной потери активности. [4] [5]
Распространенным протоколом, использовавшимся в прошлом для зимографии активности α-амилазы, был так называемый протокол крахмальной пленки WW Doane. Здесь нативный гель PAGE запускался для разделения белков в гомогенате. Затем тонкий гель с растворенным в нем крахмалом (или, точнее, суспендированным) накладывался на некоторое время поверх исходного геля. [6] Затем крахмал окрашивался йодом Люголя.
Гелевая зимография часто используется для обнаружения и анализа ферментов, вырабатываемых микроорганизмами. [7] Это привело к изменениям в стандартном протоколе, например, зимография со смешанным субстратом. [2]
Обратная зимография сополимеризует как субстрат, так и фермент с акриламидом и полезна для демонстрации активности ингибитора фермента . После окрашивания области ингибирования визуализируются как темные полосы на прозрачном (или слегка окрашенном) фоне.
В методе отпечатка фермент разделяется с помощью электрофореза в нативном геле , а гель накладывается поверх обработанной субстратом агарозы . [1]
Зимографию можно применять и к другим типам ферментов, включая ксиланазы , липазы и хитиназы.
Смотрите также
Ссылки
- ^ ab Hempelmann, E.; Putfarken, B.; Rangachari, K.; Wilson, RJM (1986). «Иммунопреципитация эндопептидазы малярийной кислоты». Паразитология . 92 (2): 305–312 . doi :10.1017/S0031182000064076. PMID 3520446. S2CID 42414630.
- ^ аб Вандоорен Дж., Гертс Н., Мартенс Э., Ван ден Стин П.Е., Опденаккер Г. (2013). «Зимографические методы визуализации гидролитических ферментов». Нат-методы . 10 (3): 211–220 . doi :10.1038/nmeth.2371. PMID 23443633. S2CID 5314901.
- ^ "Протокол зимографии желатина | Abcam". www.abcam.com . Получено 12.05.2017 .
- ^ Мартинес ТФ, Аларкон ФХ, Диас-Лопес М, Мояно ФХ (2000). «Улучшенное обнаружение активности амилазы с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и сополимеризованным крахмалом». Электрофорез . 21 (14): 2940– 2943. doi :10.1002/1522-2683(20000801)21:14<2940::AID-ELPS2940>3.0.CO;2-S. PMID 11001307. S2CID 30732170.
- ^ Snoek-van Beurden PA, Von den Hoff JW (2005). «Зимографические методы анализа матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов». BioTechniques . 38 (1): 73– 83. doi : 10.2144/05381RV01 . hdl : 2066/47379 . PMID 15679089.
- ^ Doane WW (1969). «Варианты амилазы у Drosophila melanogaster: исследования сцепления и характеристика экстрактов ферментов». J Exp Zool . 171 (3): 31– 41. Bibcode : 1969JEZ...171..321D. doi : 10.1002/jez.1401710308. PMID 5348624.
- ^ Lantz MS, Ciborowski P (1994). "Зимографические методы обнаружения и характеристики микробных протеаз" . Бактериальный патогенез. Часть A: Идентификация и регулирование факторов вирулентности . Методы в энзимологии. Т. 235. С. 563–594. doi :10.1016/0076-6879(94)35171-6. ISBN 9780121821364. PMID 8057927.
