ЕНУ

ЕНУ

Имена
Предпочтительное название ИЮПАК N -этил- N -нитрозомочевина
Другие имена N -Этилнитрозомочевина [ необходима ссылка ] 1-Этил-1-нитрозомочевина Нитрозоэтилмочевина [ необходима ссылка ] N -Нитрозо- N -Этилмочевина [1]
Идентификаторы
Номер CAS	759-73-9 И
3D модель ( JSmol )	Интерактивное изображение
Сокращения	ЕНУ [ требуется ссылка ]
Ссылка Бейльштейна	1761174
ЧЭБИ	ЧЕБИ:23995 И
ChEMBL	ChEMBL167667 И
ChemSpider	12427 И
Информационная карта ECHA	100.010.975
Номер ЕС	212-072-2
КЕГГ	C19178 Н
CID PubChem	12967
Номер RTECS	YT3150000
УНИИ	П8М1Т4190Р И
Номер ООН	2811
Панель инструментов CompTox ( EPA )	DTXSID8020593
ИнЧи ИнХI=1S/C3H7N3O2/c1-2-6(5-8)3(4)7/h2H2,1H3,(H2,4,7) И Ключ: FUSGACRLAFQQRL-UHFFFAOYSA-N И
УЛЫБКИ CCN(Н=О)С(Н)=О
Характеристики
Химическая формула	С3Н7Н3О2​​​​​​​
Молярная масса	117.108  г·моль −1
лог P	0,208
Давление пара	0,00244 кПа при 25˚C [1]
Кислотность ( pK a )	12.317
Основность (p K b )	1.680
Поглощение	ε 398 = 11,86 мМ -1 см -1 [2]
Опасности
Маркировка СГС :
Пиктограммы
Сигнальное слово	Опасность
Предупреждения об опасности	Н301 , Н312 , Н332 , Н350 , Н360
Меры предосторожности	П280 , П308+П313
Смертельная доза или концентрация (ЛД, ЛК):
LD 50 ( средняя доза )	300 мг/кг ( перорально, крыса)
Родственные соединения
Связанные мочевины	N -Нитрозо- N -метилмочевина
Родственные соединения	N -Метилформамид Диметилформамид Дейтерированный ДМФ Ацетиллейцин
Если не указано иное, данные приведены для материалов в стандартном состоянии (при 25 °C [77 °F], 100 кПа). Н проверить  ( что такое   ?)ИН Ссылки на инфобокс

ENU , также известный как N -этил- N - нитрозомочевина ( химическая формула _{C3H7N3O2 )} , является очень мощным мутагеном _. Для данного гена у мышей ENU может вызывать 1 новую мутацию в _каждых 700 локусах. Он также токсичен в высоких дозах .

Химикат является алкилирующим агентом и действует путем переноса этильной группы ENU на азотистые основания (обычно тимин ) в нуклеиновых кислотах . Его основными целями являются сперматогониальные стволовые клетки , из которых получаются зрелые сперматозоиды .

Билл Рассел (1951) создал веху в области генетики мышей , создав специально разработанную линию мышей, T (тестовую) популяцию, которая использовалась в генетических скринингах для тестирования мутагенов, таких как радиация и химикаты. Мыши T -популяции несут 7 рецессивных, жизнеспособных мутаций, влияющих на легко узнаваемые признаки. В Национальной лаборатории Оук-Ридж первоначальной целью Рассела было определить скорость наследуемых генных мутаций в зародышевой линии, вызванных радиацией. Таким образом, он решил использовать мышей T -популяции, чтобы определить, как часто набор локусов может мутировать под воздействием радиации. Поскольку мутации у мышей T -популяции были рецессивными , потомство будет иметь фенотип дикого типа (в результате скрещивания мутанта [например, мутантного самца s / s ] с самкой дикого типа [ + / + ]). Таким образом, любое потомство, несущее мутацию, вызванную радиацией в одном из 7 локусов, будет демонстрировать мутантный фенотип в самом первом поколении. Этот подход, тест специфического локуса (SLT), позволил Расселу изучить широкий спектр специфических мутаций и рассчитать частоту мутаций, вызванных радиацией. ^[3]

Помимо изучения влияния радиации на SLT, Рассел и др. также интересовались изучением влияния химических мутагенов, таких как прокарбазин и этилнитрозомочевина, на SLT. В то время прокарбазин был самым мощным химическим мутагеном, известным тем, что вызывал значительный сперматогониальный мутагенез в SLT, хотя и со скоростью, составляющей одну треть от скорости рентгеновских лучей. Более ранняя работа Рассела по мутагенезу на Drosophila с использованием диэтилнитрозамина (DEN) побудила их использовать DEN для SLT. Однако DEN необходимо ферментативно преобразовать в алкилирующий агент, чтобы стать мутагенным, и, вероятно, эта ферментативная активация была недостаточной у млекопитающих. Это можно проиллюстрировать чрезвычайно низкой частотой мутаций у мышей, которым давали DEN (3 из 60 179 потомков). Чтобы преодолеть эту проблему, Эккехарт Вегель предложил Расселу и др. использовать новый мутаген, N -этил N -нитрозомочевину (ENU), алкилирующий агент, который не нужно метаболизировать. Мыши, которым вводили ENU (250 мг/кг), прошли период стерильности в течение 10 недель. После выздоровления 90 самцов были скрещены с самками T -популяции, и было получено 7584 детеныша. ^[3] Их результаты показали, что доза ENU в 250 мг/кг способна вызывать частоту мутаций в 5 раз выше, чем при 600 Р (1R = 2,6 x10^-4 кулонов/кг) острого рентгеновского облучения. Эта частота также была в 15 раз выше, чем при прокарбазине (600 мг/кг). ^[4]

Чтобы преодолеть проблему начального периода бесплодия, группа Рассела показала, что вместо инъекции одной большой дозы ENU, дробная доза (100 мг/кг) ^[5] по еженедельному графику позволяла переносить общую более высокую дозу (300–400 мг/кг) ^[5] . Это также показало, что частота мутаций улучшилась и стала в 12 раз выше, чем у рентгеновских лучей, в 36 раз выше, чем у прокарбазина и более чем в 200 раз выше, чем у спонтанных мутаций. Когда частота мутаций была усреднена по всем 7 локусам, было обнаружено, что ENU вызывает мутации с частотой одна на локус в каждых 700 гаметах. ^[3]

1. ENU является алкилирующим агентом и имеет предпочтение к трансверсиям оснований A->T, а также к переходам AT->GC. ^[6] Однако также показано, что он вызывает переходы GC->AT. ^[7]
2. Известно, что он вызывает точечные мутации, что подразумевает, что путем картирования желаемого фенотипа исследователь может идентифицировать единственный ген-кандидат, ответственный за фенотип. ^[8]
3. Точечные мутации находятся на интервале примерно 1-2 Мб (мегапар оснований) и происходят с приблизительной частотой 1 на 700 гамет. ^[3]
4. ENU нацелен на сперматогониальные стволовые клетки. ^[6]

С тех пор, как Рассел и др. открыли ENU как наиболее мощный мутаген, он использовался в прямых (основанных на фенотипе) генетических скринингах, с помощью которых можно идентифицировать и изучать интересующий фенотип . Как показано на рисунке 1, процесс скрининга начинается с мутагенеза самца мыши с ENU. За этим следует систематический фенотипический анализ потомства. Потомство оценивается на предмет поведенческих, физиологических или дисморфологических изменений. Идентифицируется аномальный фенотип. Затем идентификация гена-кандидата достигается путем позиционного клонирования мутантных мышей с интересующим фенотипом.

ENU используется как генетический инструмент, разрабатывая различные генетические экраны, соответствующие интересам исследователей. В зависимости от региона, который оценивается, прямые генетические экраны можно классифицировать, как показано на рисунке 2, как: ^[8]

1. Скрининг, специфичный для региона : исследования специально разработаны для получения градиента фенотипов путем создания аллельных серий, которые полезны при изучении интересующего региона.
2. Полногеномные скрининги : это простые доминантные или рецессивные скрининги, которые часто полезны для понимания конкретных генетических и биохимических путей.

Региональные особенности можно классифицировать следующим образом:

Комплементация — это явление, которое позволяет генерировать фенотип дикого типа при скрещивании организмов, несущих рецессивные мутации в разных генах. ^[8] Таким образом, если организм имеет одну функциональную копию гена, то эта функциональная копия способна дополнять мутировавшую или утраченную копию гена. Напротив, если обе копии гена мутированы или утрачены, то это приведет к аллельной некомплементации (рисунок 3) и, таким образом, проявлению фенотипа.

Феномен избыточности объясняет, что часто несколько генов способны компенсировать потерю конкретного гена. Однако, если теряются два или более генов, участвующих в одних и тех же биологических процессах или путях, то это приводит к неаллельной некомплементации. При некомплементарном скрининге самец, индуцированный ENU, скрещивается с самкой, несущей мутантный аллель ( a ) интересующего гена (A). Если мутация доминантная, то она будет присутствовать в каждом поколении. Однако, если мутация рецессивная или если потомство G ₁ нежизнеспособно, то для идентификации мутации используется другая стратегия. Самец, обработанный ENU, скрещивается с самкой дикого типа. Из пула особей G ₁ гетерозиготный самец скрещивается с самкой, несущей мутантный аллель ( a ). Если потомство G ₂ бесплодно или нежизнеспособно, его можно снова восстановить из самца G ₁ .

Делеции на хромосомах могут быть спонтанными или индуцированными. В этом скрининге самцов, обработанных ENU, скрещивают с самками, гомозиготными по делеции интересующей области. Потомство G ₁ является сложными гетерозиготами по мутации, индуцированной ENU (рисунок 4). Кроме того, они гаплоидны по отношению к генам в удаленной области, и, таким образом, потеря функции или приобретение функции из-за мутации, индуцированной ENU, выражается доминантно. Таким образом, скрининг делеций имеет преимущество перед другими рецессивными скринингами из-за идентификации мутации в самом потомстве G ₁ .

Ринчик и др . провели скрининг делеций и анализ комплементации и смогли выделить 11 независимых рецессивных локусов, которые были сгруппированы в семь групп комплементации на хромосоме 7, области, окружающей ген альбинизма ( Tyr ) и ген разбавления розовых глаз ( p ). ^[8]

• в) Балансировочные экраны

Хромосома, несущая балансировочную область, называется балансировочной хромосомой . Балансировочная хромосома — это область, которая предотвращает рекомбинацию между гомологичными хромосомами во время мейоза. Это возможно из-за наличия инвертированной области или серии инверсий. Балансировочная хромосома в основном использовалась для исследований в области генетики Drosophila melanogaster . Моника Джастис и др. (2009) эффективно провели скрининг балансировочной хромосомы, используя балансировочную хромосому, сконструированную Алланом Брэдли и др. на мышиной хромосоме 11. В этом скрининге самец, индуцированный ENU, скрещивается с самкой, гетерозиготной по балансировочной хромосоме. ^[8] У мышей, несущих балансировочную хромосому, желтые уши и хвост. Гетерозиготы G ₁ (рисунок 5) скрещиваются с самками, несущими мутацию rex ( Rex на рисунке 5), которая придает курчавую шерсть. В G ₂ гомозиготы по балансировочной хромосоме нежизнеспособны и не восстанавливаются. Мыши, несущие мутацию rex trans в балансер или мутацию, вызванную ENU, имеют курчавую шерсть и отбраковываются. Мыши с мутацией ENU + rex отбраковываются, чтобы предотвратить рекомбинацию между этими двумя хромосомами на следующем этапе разведения, на котором производятся гомозиготные мутанты. Мыши, являющиеся сложными гетерозиготами по балансеру и мутации, вызванной ENU, спариваются по схеме брат-сестра для получения гомозигот по мутации, вызванной ENU в G ₃ .

Геномные скрининги чаще всего полезны для изучения генетических заболеваний, в которых могут быть задействованы множественные генетические и биохимические пути. Таким образом, с помощью этого подхода можно идентифицировать гены-кандидаты или регионы по всему геному, которые связаны с фенотипом.

• а. Обычные экраны

Эти скрининги могут быть разработаны для идентификации простых доминантных и рецессивных фенотипов. (Рисунок 6). Таким образом, самец G ₀ , индуцированный ENU, скрещивается с самкой дикого типа. Потомство G 1 может быть проверено для выявления доминантных мутаций. Однако, если мутация рецессивная, то особи G _3, гомозиготные по мутации, могут быть получены из самцов G ₁ двумя способами:

• A] Самец G ₁ скрещивается с самкой дикого типа для получения пула потомства G _2. Особи G ₃ могут быть получены путем скрещивания самца G ₁ с дочерьми G _2. Это даст долю особей G ₃ , которые в значительной степени напоминают самца G _{1 .}
• B] Самец G ₁ скрещивается с самкой дикого типа для получения пула животных G ₂ , которые затем скрещиваются по типу брат-сестра для получения потомства G _3. Этот подход дает множество мутантов в потомстве G ₃ .

Ряд организаций по всему миру проводят скрининг мутагенеза по всему геному с использованием ENU. Некоторые из них включают Институт экспериментальной генетики Немецкого исследовательского центра по охране окружающей среды (GSF), Мюнхен, Германия; Лаборатория Джексона, Мэн, США; Австралийский центр феномики Австралийского национального университета, Канберра, Австралия; Кафедра нейробиологии и физиологии Северо-Западного университета, Иллинойс, США; Национальная лаборатория Оук-Ридж, Теннесси, США; Медицинский исследовательский совет (MRC), Харвелл, Оксфордшир, Великобритания; Кафедра генетики Научно-исследовательского института Скриппса, Калифорния, США; Центр мутагенеза мышей при дефектах развития Медицинского колледжа Бейлора, Техас, США; и другие. ^[6]

• б) Экраны-модификаторы

Модификатор, такой как энхансер или супрессор, может изменить функцию гена. При скрининге модификаторов выбирается организм с уже существующим фенотипом. Таким образом, любые мутации, вызванные мутагеном (ENU), можно оценить на предмет их усиливающей или подавляющей активности. ^[8] Скрининг на доминантные и рецессивные мутации выполняется способом, аналогичным обычному скринингу по всему геному (рисунок 7). Ряд скринингов модификаторов был проведен на Drosophila . Недавно Алига и др. провели скрининг на доминантные модификаторы с использованием мышей, индуцированных ENU, для идентификации модификаторов сигнального пути Notch. ^[9] Дельта 1 является лигандом для рецептора Notch. Гомозиготная потеря функции Дельта 1 ( Dll1 ^lacZ/lacZ ) является эмбрионально летальной. Мыши, обработанные ENU, были скрещены с гетерозиготами Dll1 ^lacZ _{. В G1} было получено 35 мутантных линий, из которых 7 выявили модификаторы сигнального пути Notch.

В случае генетических заболеваний, включающих несколько генов, мутации в нескольких генах способствуют прогрессированию заболевания. Однако мутация только в одном из этих генов может не вносить существенного вклада в какой-либо фенотип. Такие «предрасполагающие гены» можно идентифицировать с помощью сенсибилизированных скринингов. ^[10] При этом типе скрининга генетический или экологический фон модифицируется таким образом, чтобы сенсибилизировать мышь к этим изменениям. Идея заключается в том, что предрасполагающие гены можно раскрыть на измененном генетическом или экологическом фоне. Ринчик и др. провели сенсибилизированный скрининг мутантов мышей, предрасположенных к диабетической нефропатии. Мышей лечили ENU на сенсибилизированном фоне диабета 1 типа. Эти диабетические мыши имели доминирующую мутацию Акита в гене инсулина-2 ( Ins2 ^Акита ). У этих мышей развилась альбуминурия, фенотип, который не наблюдался у недиабетического потомства. ^[11]

В целом, ENU довольно нестабилен, что облегчает его инактивацию при использовании в качестве экспериментального мутагена по сравнению с умеренно более стабильными мутагенами, такими как EMS . Чистый кристаллический ENU чувствителен к свету и влаге, поэтому его следует хранить в холодных и сухих условиях и при необходимости готовить свежеприготовленные растворы. ^[1] В водных растворах ENU быстро разлагается при щелочном pH, и протоколы требуют инактивации растворов ENU равным объемом 0,1 М KOH в течение 24 часов с воздействием окружающего света или без него для дополнительной инактивации. ^[2]

• Мутагенез (метод молекулярной биологии)
• Этилметансульфонат (ЭМС)

• Институт экспериментальной генетики, Немецкий исследовательский центр по охране окружающей среды (GSF), Мюнхен, Германия ^{[ постоянная мертвая ссылка ]}
• Программа репродуктивной геномики, Лаборатория Джексона, Мэн, США
• Центр нейробиологического мутагенеза, Лаборатория Джексона, Мэн, США
• Центр заболеваний сердца, легких, крови и сна у мышей (HLBS), Лаборатория Джексона, Мэн, США
• Австралийский центр феномики в Австралийском национальном университете, Канберра, Австралия. Архивировано 05.10.2018 в Wayback Machine.
• Центр химического мутагенеза мышей, кафедра нейробиологии и физиологии Северо-Западного университета, Иллинойс, США
• Национальная лаборатория Оук-Ридж, Теннесси, США
• Медицинский исследовательский совет (MRC) Харвелл, Оксфордшир, Соединенное Королевство Архивировано 10 сентября 2008 г. в Wayback Machine
• Mutagenetix, Отдел генетики, Научно-исследовательский институт Скриппса, Калифорния, США
• Центр мутагенеза мышей при дефектах развития, Медицинский колледж Бейлора, Техас, США
• Центр геномных наук RIKEN, Институт Йокогамы, Япония. Архивировано 14 июня 2008 г. на Wayback Machine.
• ПРОТОКОЛ: Мутагенез мышей с использованием N-этил-N-нитрозомочевины (ENU)