Миелиновидный

Миелиноид или миелиновый органоид — это трехмерная in vitro культивируемая модель, полученная из человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC), которая представляет различные области мозга, спинной мозг или периферическую нервную систему на раннем этапе развития плода человека. ^[1] [ ^{2] [3]} Миелиноиды обладают способностью воспроизводить аспекты процессов развития мозга, микросреды, взаимодействия клеток, структурной организации и клеточного состава. ^{[2] [3]} Дифференциальным аспектом, определяющим, считается ли органоид церебральным органоидом /органоидом мозга или миелиноидом, является наличие миелинизации и компактного образования миелина , что является определяющей чертой миелиноидов. Из-за сложной природы человеческого мозга существует потребность в модельных системах, которые могут точно имитировать сложные биологические процессы. Миелиноиды представляют собой уникальную in vitro модель, с помощью которой можно проводить патологию миелина, нейродегенеративные заболевания, процессы развития и терапевтический скрининг. ^{[1] [2]}

Модели in vitro были критически важным компонентом многих биологических исследований. Монослои , или 2D-культуры, широко использовались в прошлом, однако они ограничены своей недостаточной сложностью и не могут воспроизвести архитектуру тканей, участвующих в биологических процессах, происходящих in vivo. ^[4] Модельные организмы, такие как Mus musculus , Caenorhabditis elegans , Drosophila melanogaster и Saccharomyces cerevisiae , воспроизводят биологическую сложность лучше, чем 2D-монослойные культуры. ^{[5] [6]} Однако эти модельные организмы не полностью отражают человеческую биологию. В частности, существуют резкие различия в развитии мозга между мышами и людьми. Основные различия в развитии включают изменчивость моделей деления нейральных стволовых клеток , а также локализацию и типы глиальных клеток , которые встречаются на определенных стадиях развития. ^{[7] [8]}

Используя технологии плюрипотентных стволовых клеток, были разработаны мозговые органоиды и церебральные органоиды для заполнения пробела в модельных системах для изучения развития и патологии человеческого мозга in vitro. Первый церебральный органоид был создан в 2013 году. ^[9] С тех пор появились различные протоколы для создания органоидов для различных областей мозга, таких как мозжечковый , ^[10] гиппокампальный , ^[11] средний мозг , ^[12] передний мозг , ^[13] и гипоталамический ^[14] органоиды. Церебральные органоиды представляют собой неврологическую модель, с помощью которой можно изучать заболевания, развитие и терапию. ^[15] Однако основным ограничением церебральных органоидов является то, что у них отсутствует надежное образование миелина, и поэтому они не очень подходят для исследований, изучающих белое вещество .

Это ограничение церебральных органоидов было устранено в 2018 году, когда были созданы мозговые органоиды, содержащие надежную популяцию миелинизирующих олигодендроцитов . Процесс создания этих миелинизированных мозговых органоидов длился 210 дней и включал добавление различных факторов роста и сред в определенные временные точки. ^[2] Из-за длительной продолжительности протокола 2018 года были предприняты попытки ускорить и оптимизировать дифференциацию и создание этих миелинизированных органоидов. Похожий протокол, который немного отличался добавленными факторами роста и временем смены сред, был описан в 2019 году. Этот протокол позволил создать органоиды с компактным образованием миелина к 160-му дню. ^[16]

Другой протокол, разработанный в 2019 году, продемонстрировал, что генерация миелинизированных органоидов может быть ускорена еще больше. Используя новый протокол, основной белок миелина (MBP), маркер дифференцировки олигодендроцитов и миелинизации в ЦНС, можно было обнаружить уже на 63-й день (9 недель), а миелинизированные аксоны наблюдались на 105-й день (15 недель), что фактически вдвое сократило продолжительность протокола. ^{[17] [18]}

Протокол аналогичной продолжительности был создан в 2021 году, однако полученные органоиды немного отличаются по своему биологическому контексту. Этот протокол использовал тот факт, что миелинизация спинного мозга наблюдается до миелинизации коры. ^[1] Этот протокол генерировал органоиды с надежной миелинизацией с вентрально-каудальной судьбой клеток. ^[1] Эти органоиды, хотя технически и не являются мозговыми органоидами, также могут быть использованы для изучения патологии миелиновых заболеваний, что было подтверждено в исследовании путем создания органоидов, повторяющих патологию заболевания, наблюдаемую у пациентов с Nfasc 155-/-. В этом протоколе они назвали свои миелинизированные органоиды «миелиноидами», таким образом создав категорию органоидов, называемых миелиноидами. ^[1]

В 2021 году группа исследователей поставила перед собой задачу рассмотреть тот факт, что длительные протоколы дифференциации делают миелиноиды менее практичными для высокопроизводительных экспериментов, таких как скрининг лекарственных препаратов. ^[19] Для этого ученые разработали линию человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC), которая основана на ранней экспрессии олигодендроглиального гена, что позволило ускорить генерацию миелинизированных органоидов всего за 42 дня. ^[19] На сегодняшний день это самый быстрый протокол для генерации зрелых олигодендроцитов в органоиде мозга. ^[19]

Для создания органоидов плюрипотентным стволовым клеткам человека (hPSC) позволяют агрегировать в эмбриональные тельца (EB) в пластинах с низкой степенью прикрепления (в суспензии), которые затем культивируют во вращающемся биореакторе с факторами, специфичными для линии, для стимулирования амплификации, роста и дифференциации клеток. ^{[2] [20] [21]} EB обладают способностью дифференцироваться во все эмбриональные зародышевые слои, мезодерму, энтодерму и эктодерму. In vivo нервная система, включая миелин, генерируется из эктодермы. ^[21] Чтобы повторить это in vitro и создать миелиновые органоиды, EB культивируют в средах со специфическими факторами роста и добавками, которые приводят к эктодермальной дифференциации, с последующей нейронной индукцией. ^[21] Более конкретно, добавляются факторы нейронной индукции, чтобы вызвать образование нейронных клеток-предшественников, которые дают начало нейронам и глиальным клеткам, включая олигодендроциты, in vivo . ^[2]

Хорошо зарекомендовавший себя метод, используемый для эффективной дифференциации hPSC в нервные клетки, заключается в двойном ингибировании сигнализации SMAD с использованием дорсоморфина (также известного как соединение C) и SB431542. ^{[1] [2] [22] [23]} Для стимуляции дальнейшей пролиферации нервных клеток-предшественников в среду добавляются специфические факторы роста, такие как эпидермальный фактор роста (EGF) и фактор роста фибробластов 2 (FGF-2). ^{[2] [23] [24]} Перед нейронной и глиальной индукцией сфероиды обычно помещают во внеклеточный матрикс , такой как Матригель, и переносят во вращающийся биореактор, где непрерывно добавляются различные малые молекулы и факторы роста, чтобы способствовать дифференциации клеток в определенные структуры и типы клеток. ^{[2] [20] [23]}

In vivo нейрональная индукция предшествует образованию олигодендроцитов. ^[25] Поэтому в культуре сначала добавляются факторы нейрональной индукции, чтобы вызвать нейрокортикальное паттернирование сфероидов, а затем факторы, которые индуцируют образование клеток-предшественников олигодендроцитов (OPC) и дифференциацию в олигодендроглию. ^{[2] [23]} Чтобы способствовать образованию нейронов из нейрональных клеток-предшественников, в среду можно добавлять нейротрофический фактор мозга (BDNF) и нейротрофический фактор 3 (NT3). ^{[2] [23]} Затем в среду добавляют такие факторы, как тромбоцитарный фактор роста AA (PDGF-AA) и инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1), чтобы вызвать расширение популяций OPC, присутствующих в органоиде, путем содействия пролиферации и выживанию OPC. ^{[1] [2]}

Наконец, добавляются факторы, которые вызывают дифференциацию OPC в олигодендроциты и, в конечном счете, миелинизирующие олигодендроциты. ^{[1] [ 2]} Сюда входит гормон щитовидной железы (Т3), который, как было показано, вызывает образование олигодендроцитов из OPC in vivo. ^{[1] [2]} Органоиды поддерживаются в суспензии, где они растут и созревают до тех пор, пока не потребуются для анализа. Основы этого рабочего процесса обычно используются для получения миелиновых органоидов; однако различные протоколы, которые на нем основаны, ввели множество модификаций для разных целей. Мадхаван и др. были первыми, кто разработал воспроизводимый протокол, который позволил генерировать органоиды с устойчивыми популяциями OPC и олигодендроцитов, и, следовательно, миелинизацией; их называют миелиновыми органоидами или миелиноидами. ^[2]

Генерация миелиновых органоидов обычно зависит от нейрокортикальных паттернирующих факторов, которые устанавливают структурный и клеточный каркас, необходимый для индукции олигодендрогенеза на более поздних стадиях дифференцировки. ^[2] Таким образом, свойства и компоненты миелиновых органоидов на ранних стадиях дифференцировки очень похожи на те, которые наблюдаются в церебральных органоидах, где популяции нейральных прогениторных клеток, предшественников нейронов и глиальных клеток, начинают появляться и самоорганизовываться в отдельные слои, которые повторяют особенности коры во время раннего эмбриогенеза. ^[3]

На таких ранних стадиях миелиновые органоиды начинают формировать большой непрерывный нейроэпителий, который охватывает заполненную жидкостью полость, представляющую желудочек мозга. ^[9] Клетки-предшественники, окружающие предполагаемый желудочек, организуются в отдельные слои, определяемые специфическими нейронными маркерами, которые становятся более определенными по мере созревания органоида. ^[9] Слои включают желудочковую зону, окружающую полость, с клетками, экспрессирующими PAX6, SOX2 и Ki67, за которой следует внешняя субвентрикулярная зона и промежуточная зона с клетками, экспрессирующими Ki-67 и TBR2, и, наконец, слой кортикальной пластинки с клетками, экспрессирующими CTIP2 , MAP2 и TBR1 . ^[3]

После нейрокортикального паттернирования факторы роста линии олигодендроцитов стимулируют расширение собственных популяций распределенных OPC, вызывая существенное увеличение их числа, которые экспрессируют SOX6 , SOX10 и OLIG2 , маркеры глиальной индукции и спецификации OPC. ^[2] По мере созревания миелинового органоида клетки OPC дифференцируются в олигодендроциты, которые экспрессируют протеолипидный белок 1 ( PLP1 ), преобладающий компонент миелина, и MYRF25, специфичный для олигодендроцитов фактор транскрипции . ^[2] Олигодендроциты распределяются по нейронным слоям, где после созревания их отростки экспрессируют MBP и CNP (ранний маркер миелинизации), начинают расширяться, чтобы обернуть и миелинизировать окружающие их аксоны. Миелин подвергается созреванию, уточнению и уплотнению, что в конечном итоге приводит к формированию функциональных нейронных сетей с компактно обернутыми миелиновыми пластинками. ^{[1] [2]} Дальнейшее созревание миелина приводит к образованию отдельных аксональных субдоменов с паранодальным аксо-глиальным соединением (PNJ) и узлом Ранвье . Наблюдение за паранодальной и узловой сборкой зависит от протокола, некоторые наблюдают паранодальную и узловую сборку, некоторые — нет. В целом, олигодендроциты в миелиновых органоидах демонстрируют способность образовывать компактный миелин, который обволакивает и организует вокруг нейронных аксонов, повторяя трехмерную архитектуру миелинизированных аксональных сетей у людей.

Миелиноиды повторяют различные фундаментальные аспекты развития мозга и миелинизации, и, следовательно, связанные с ними заболевания и патологии. Учитывая это, их можно использовать для моделирования различных заболеваний и понимания механизмов заболеваний, связанных с дефектами миелина, включая нейродегенеративные заболевания, повреждения ЦНС, PMD и NFASC. ^{[1] [2] [17]}

PMD — редкое моногенное заболевание, вызванное различными мутациями гена протеолипидного белка 1 , сцепленного с Х-хромосомой (PLP1). ^[26] PLP1 — критический белок для образования миелина. PMD классифицируется как лейкодистрофия, что означает, что это заболевание, поражающее белое вещество мозга. Мадхаван и др. проверили, насколько хорошо их миелиноидная система может воспроизводить установленную клеточную патологию PMD. Органоиды были получены от трех пациентов с различной степенью тяжести заболевания, где у субъекта с делецией, дупликацией и точечной мутацией были легкие, умеренные и тяжелые фенотипы соответственно. ^[2] Их результаты продемонстрировали, что полученные миелинизирующие олигокортикальные сфероиды повторяют степени клеточной патологии, связанные с генетическими вариантами, поэтому могут служить моделями для понимания взаимосвязей между генотипами и фенотипами ПМД, которые еще не полностью охарактеризованы. ^[2]

Ген NFASC кодирует молекулу клеточной адгезии, которая участвует в росте нейритов и фасцикуляции . ^[27] Кроме того, NFASC участвует в организации сегмента инициации аксона и перехватов Ранвье во время развития. ^[27] Пациенты с бессмысленными мутациями в NFASC имеют аномалии в паранодальном аксо-глиальном соединении (PNJ). ^[1] Джеймс и др. продемонстрировали, что миелиноиды, полученные от пациента, имели широко распространенное образование миелиноидов как у пациента, так и у контрольной группы; однако, как и ожидалось, PNJ в миелиноидах, полученных от пациента, нарушило формирование паранодов. ^[1]

Структуру и целостность миелина изначально трудно изучать у людей на молекулярном уровне. МРТ может пролить свет на аномалии миелина в человеческом мозге, однако многие исследования используют модели животных для изучения изменений, связанных с миелином, в ответ на генетические варианты. Миелиноиды предоставляют трехмерную систему, полученную от человека, для изучения структуры миелина. ^[2] Измерение количества и длины миелиновых оболочек, паранодальной/узловой организации и структуры, объема и уплотнения миелина, клеточной идентичности и состава, а также клеточной организации — все это методы количественной оценки изменений миелина. ^[1]

Исследования показали, что в миелиноидах человеческая миелинизация может быть фармакологически манипулирована количественно как на клеточном, так и на глобальном уровне по всем миелиноидам. ^[1] Таким образом, миелиновые органоиды могут быть использованы в качестве доклинической модели для оценки миелин-ассоциированных потенциальных терапевтических средств и лекарств в физиологически релевантном для человека контексте. ^[2]

Миелиновые органоиды могут быть использованы для изучения терапевтического потенциала возможных стратегий миелинизации для людей с заболеваниями, связанными с демиелинизацией, такими как лейкодистрофии и рассеянный склероз , аутоиммунное демиелинизирующее заболевание, поражающее ЦНС. ^{[2] [28] [29]} Клемастин и кетоконазол являются промиелинизирующими препаратами, которые действуют как мощные стимуляторы генерации олигодендроцитов и миелинизации в моделях грызунов. Ранее известные эффекты обоих препаратов были воспроизведены с использованием миелиновых органоидов, поскольку они усиливали и ускоряли степень и скорость генерации олигодендроцитов, созревания и миелинизации в органоидах. ^[2]

Некоторые классы болезни Пелицеуса-Мерцбахера (ПМД), протеолипидный белок 1 (PLP1) демонстрируют перинуклеарную задержку в олигодендроцитах. ^[30] Перинуклеарная задержка неправильно свернутых белков является отличительной чертой стресса эндоплазматического ретикулума (ЭР), который может быть причастен к патологии, наблюдаемой при ПМД. ^[30] В миелиноидной модели болезни Пелицеуса-Мерцбахера (ПМД), разработанной в 2018 году, лечение модулятором путей стресса ЭР под названием GSK2656157, ингибитором протеинкиназо-R-подобной ЭР-киназы, частично восстановило перинуклеарную задержку PLP1, мобилизовав его из ЭР в отростки олигодендроцитов. ^[2] Кроме того, лечение привело к увеличению количества клеток, которые демонстрируют экспрессию MYRF, фактора транскрипции, специфичного для олигодендроцитов, уровень которого, как было отмечено, снижен в олигодендроцитах PMD по сравнению с контрольной группой. ^[2]

В миелиноидной модели PMD, вызванной точечными мутациями в протеолипидном белке 1 (PLP1), коррекция CRISPR последовательности дикого типа в hPSC, использованных для ее создания, спасла некоторые аспекты патологии PMD. ^[2] Лечение восстановило перинуклеарное удержание PLP1 и мобилизацию в отростки олигодендроцитов и увеличило количество олигодендроцитов, которые экспрессируют MYRF, специфический маркер олигодендроцитов, до уровней, наблюдаемых у здоровых контрольных лиц. ^[2] Миелиновые органоиды, полученные из hPSC после коррекции CRISPR точечных мутаций PLP1, генерировали миелин после 20 недель культивирования. ^[2]

«Омикс» широко применяется к органоидам, и с момента разработки технологии органоидов стали использоваться анализы транскриптома, эпигенома, протеома и метаболома. ^[31] Кроме того, с использованием органоидов изучались целевое редактирование генов и взаимодействия хозяина и микробиома. ^[31]

Невозможно изучать паттерны экспрессии генов мозга у людей, поэтому возможность воссоздать некоторые аспекты сложности человеческого мозга in vitro позволяет исследовать аспекты развития и болезней человека. Одноклеточная омика — это мощный инструмент, который использовался для идентификации различных субпопуляций клеток-предшественников олигодендроцитов (OPC) и зрелых олигодендроцитов в мышиных моделях, которые ранее не были определены. ^[32] Гетерогенность олигодендроцитов ранее считалась функционально однородной; однако различные популяции клеток можно охарактеризовать с помощью специфических транскрипционных сигнатур и профилей онтологии генов .

Анализ секвенирования РНК отдельных клеток (scRNA seq) миелиноидов, проведенный в 2018 году, подтвердил, что на протяжении нескольких стадий развития в олигокортикальных сфероидах существовали отдельные популяции олигодендроцитов, которые близко соответствовали данным транскриптома отдельных клеток, полученным из коры головного мозга плода человека. ^[2] Благодаря их близкому транскриптомному сходству с данными мозга плода человека, регуляторный ландшафт клеток внутри церебральных органоидов может информировать о базовых регуляторных механизмах, управляющих развитием человеческого мозга. ^[33]

В 2020 году исследователи описали подход к получению значимой scRNA seq и анализа для хроматина, доступного транспозазе, с использованием данных секвенирования (ATAC-seq) из органоидов мозга. ^[33] Протокол, вероятно, может быть перенесен на миелиновые органоиды из-за схожей биологии между церебральными органоидами и миелиноидами.

Orgo-seq — это структура, с помощью которой можно интегрировать данные секвенирования объемной РНК (bRNA) и scRNA органоидов. ^[34] Эта платформа была разработана для решения проблем, связанных с фенотипированием органоидов, и продемонстрировала свою способность идентифицировать критические типы клеток и гены-драйверы, специфичные для типов клеток, связанные с нарушениями развития нервной системы и проявлениями заболеваний. ^[34]

Используя фреймворк Orgo-Seq, три набора данных (bRNA-seq из органоидов, полученных от доноров, данные scRNA-seq из церебральных органоидов и эмбриональных мозгов в драгоценных исследованиях и bRNA-seq из проекта BrainSpan по посмертным человеческим мозгам) были использованы для изучения вариантов числа копий при расстройствах аутистического спектра. Они использовали несколько наборов данных для определения типов присутствующих клеток и генов-драйверов, специфичных для клеток, в органоидах, полученных от пациентов.

Органоиды мозга служат в качестве модели, полученной от человека, с помощью которой можно изучать генетическую изменчивость и ее влияние на специфические процессы клеток и связь с нейродегенеративными расстройствами и расстройствами нейроразвития. ^[34] В частности, миелиноиды предоставляют систему для изучения специфических эффектов типа клеток в олигодендроцитах, которые нарушены генетическими вариантами. В целом, Orgo-Seq предоставляет количественную и проверенную структуру для исследования генов-драйверов и их роли в неврологических и неврологических расстройствах. ^[34] В будущем Лим и др. стремятся разработать структуру точной медицины для идентификации генных сетей и эффектов генетических вариантов в органоидной системе, которая будет включать миелиноиды, которые воспроизводят точный генетический фон пациента. ^[34]

• Более физиологически релевантны для людей по сравнению с животными моделями
• Более точное воспроизведение сложности человеческого мозга, чем монослои олигодендроцитов (система 2D-моделей)
• Содержит гораздо более прочные популяции OPC и миелинизирующих олигодендроцитов по сравнению с церебральными органоидами (компактное миелиновое образование)
• Персонализированная терапия – миелиноиды из iPSC, полученных от пациентов

При отсутствии человеческой мозговой ткани миелиноиды предлагают беспрецедентные возможности для изучения олигогенеза и миелинизации. ^[17] Хотя животные модели представляют ценность для изучения человеческих заболеваний, они не полностью воспроизводят развитие человеческого мозга и демонстрируют множество несоответствий, влияющих на их переносимость в физиологию человека. ^[20] Учитывая сходство миелиновых органоидов с человеческим мозгом, они были предложены в качестве моделей, соединяющих животные модели и физиологию человека. ^[3]

Были созданы и другие системы олигодендроцитов, полученные из hPSC, такие как двумерные (2D) модели монослойных олигодендроцитов. ^[2] Однако, по сравнению с 2D-системами, миелиновые органоиды более точно воспроизводят структуру и функциональность развивающегося человеческого мозга, содержащего более физиологически релевантную микросреду, включая их трехмерную цитоархитектуру, нейронные цепи, клеточные взаимодействия и в целом более физиологически релевантную микросреду. ^{[2] [3]}

Хотя церебральные органоиды формируют цитоархитектуру и состав мозга, в них, как правило, отсутствуют олигодендроциты — клетки, отвечающие за миелинизацию в центральной нервной системе. ^[2] Миелиноидный протокол, впервые представленный в 2018 году и впоследствии модифицированный другими, предлагает воспроизводимый метод создания органоидов с надежными популяциями OPC и олигодендроцитов, которые отслеживают эндогенные нейроны, формирующие функциональные нейронные сети, покрытые миелином. ^{[2] [19]}

Наконец, способность генерировать миелиноиды из hPSC, полученных от пациента (индуцированные PSC), дает большие преимущества и возможности для изучения патогенеза, специфичного для пациента, на стадиях развития и созревания олигодендроцитов. Это позволяет разрабатывать персонализированные терапевтические подходы. ^{[2] [18]}

• Экспериментальная изменчивость
• Длительный протокол генерации миелиноидов
• Невозможность охватить все типы клеток и определенные фенотипы (т.е. поведенческие аномалии)
• Некротический галоп

Как и в случае с любой модельной системой, миелиноиды имеют свои ограничения. Из-за методов, используемых для создания органоидов, может быть большая степень экспериментальной изменчивости. ^[18] Кроме того, из-за большой продолжительности, в течение которой происходит миелинизация, оптимизация дозировки молекул и методов лечения, участвующих в развитии миелина, может быть затруднена. ^[1] Преимущество скрининга лекарств в этой модели имеет свои собственные ограничения. Может быть сложно масштабировать эксперимент с миелиноидами до соответствующего масштаба для высокопроизводительного скрининга из-за большой продолжительности протоколов и ограниченной эффективности. ^[18]

Миелиноиды захватывают большое количество типов клеток, обнаруженных in vivo, однако они не захватывают все типы клеток. Микроглия отсутствует в некоторых миелиноидах, как было отмечено в протоколе 2021 года. ^[1] Миелиноиды также не захватывают никаких поведенческих аномалий.

Наконец, проблема всех органоидных культур заключается в том, что они полагаются на диффузию для достижения клеток питательными веществами. Поэтому многие органоиды будут развивать некротический центр из-за отсутствия питательных веществ, поступающих в самые внутренние клетки. ^[35] В последнее время развитие васкуляризированных органоидов представляет интерес и может потенциально облегчить эту проблему. ^[36] Однако миелиноиды, как описано в текущих протоколах, не васкуляризированы.