Мицеллярная жидкостная хроматография

This article is written like a personal reflection, personal essay, or argumentative essay that states a Wikipedia editor's personal feelings or presents an original argument about a topic. Please help improve it by rewriting it in an encyclopedic style. (September 2008) (Learn how and when to remove this message)

Мицеллярная жидкостная хроматография ( МЖХ ) — это форма обращенно-фазовой жидкостной хроматографии , в которой в качестве подвижной фазы используются водные мицеллярные растворы. ^[1]

Использование мицелл в высокоэффективной жидкостной хроматографии было впервые введено Армстронгом и Генри в 1980 году. ^{[2] [3]} Этот метод используется в основном для улучшения удерживания и селективности различных растворенных веществ , которые в противном случае были бы неразделимы или плохо разделены. Мицеллярная жидкостная хроматография (МЖХ) использовалась в различных приложениях, включая разделение смесей заряженных и нейтральных растворенных веществ, прямую инъекцию сыворотки и других физиологических жидкостей, анализ фармацевтических соединений , разделение энантиомеров , анализ неорганических металлоорганических соединений и множество других.

Одним из главных недостатков метода является снижение эффективности, вызванное мицеллами. Несмотря на иногда низкую эффективность, МЖК является лучшим выбором, чем ионообменная ЖХ или ионно-парная ЖХ для разделения заряженных молекул и смесей заряженных и нейтральных видов . ^[1] Некоторые из аспектов, которые будут обсуждаться, - это теоретические аспекты МЖК, использование моделей для прогнозирования удерживающих характеристик МЖК, влияние мицелл на эффективность и селективность, а также общие применения МЖК.

Высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой (RP-HPLC) включает неполярную неподвижную фазу, часто углеводородную цепь , и полярную подвижную или жидкую фазу. Подвижная фаза обычно состоит из водной части с органической добавкой, такой как метанол или ацетонитрил . Когда раствор аналитов вводится в систему, компоненты начинают разделяться из подвижной фазы и взаимодействовать с неподвижной фазой. Каждый компонент взаимодействует с неподвижной фазой по-разному в зависимости от его полярности и гидрофобности . В обращенно-фазовой ВЭЖХ растворенное вещество с наибольшей полярностью будет меньше взаимодействовать с неподвижной фазой и проводить больше времени в подвижной фазе. По мере уменьшения полярности компонентов время, проведенное в колонке, увеличивается. Таким образом, разделение компонентов достигается на основе полярности. ^[4] Добавление мицелл в подвижную фазу вводит третью фазу, в которую могут разделяться растворенные вещества.

Мицеллы состоят из поверхностно-активных веществ или детергентов, мономеров с гидрофобной частью или хвостом на одном конце и гидрофильной частью или головной группой на другом. Полярная головная группа может быть анионной , катионной , цвиттер-ионной или неионной. Когда концентрация поверхностно-активного вещества в растворе достигает своей критической концентрации мицелл (ККМ), оно образует мицеллы, которые являются агрегатами мономеров. ККМ различна для каждого поверхностно-активного вещества, как и количество мономеров, составляющих мицеллу, называемое числом агрегации (АН). ^[5] В таблице 1 перечислены некоторые распространенные детергенты, используемые для образования мицелл, а также их ККМ и АН, если таковые имеются.

Многие характеристики мицелл отличаются от характеристик объемных растворителей. Например, мицеллы по своей природе пространственно неоднородны с углеводородным, почти безводным ядром и высокосольватированной полярной головной группой. Они имеют высокое отношение поверхности к объему из-за своего малого размера и, как правило, сферической формы. Их окружающая среда ( pH , ионная сила, буферный ион, наличие сорастворителя и температура ) оказывает влияние на их размер, форму, критическую концентрацию мицелл, число агрегации и другие свойства. ^[6]

Другим важным свойством мицелл является точка Крафта, температура, при которой растворимость поверхностно-активного вещества равна его ККМ. Для применений ВЭЖХ, связанных с мицеллами, лучше всего выбирать поверхностно-активное вещество с низкой точкой Крафта и ККМ. Высокая ККМ потребует высокой концентрации поверхностно-активного вещества, что увеличит вязкость подвижной фазы, что является нежелательным состоянием. Кроме того, точка Крафта должна быть значительно ниже комнатной температуры, чтобы избежать необходимости подачи тепла на подвижную фазу. Чтобы избежать возможных помех с детекторами поглощения, поверхностно-активное вещество также должно иметь небольшую молярную поглощательную способность на выбранной длине волны анализа. Рассеивание света не должно вызывать беспокойства из-за малого размера мицеллы , несколько нанометров . ^[1]

Влияние органических добавок на мицеллярные свойства является еще одним важным соображением. Небольшое количество органического растворителя часто добавляется в подвижную фазу, чтобы повысить эффективность и улучшить разделение соединений. Необходимо соблюдать осторожность при определении того, сколько органики добавлять. Слишком высокая концентрация органики может привести к диспергированию мицеллы, поскольку ее образование зависит от гидрофобных эффектов. Максимальная концентрация органики зависит от самого органического растворителя и от мицеллы. Эта информация, как правило, точно не известна, но общепринятой практикой является поддержание объемного процента органики ниже 15–20%. ^[1]

Фишер и Джандера ^[7] изучали влияние изменения концентрации метанола на значения ККМ для трех обычно используемых поверхностно-активных веществ. Для эксперимента были выбраны два катионных, гексадецилтриметиламмоний бромид (CTAB) и N-(a-карбэтоксипентадецил)триметиламмоний бромид ( Septonex ), и одно анионное поверхностно-активное вещество, додецилсульфат натрия (SDS). В общем, ККМ увеличивалась с увеличением концентрации метанола. Затем был сделан вывод, что распределение поверхностно-активного вещества между объемной подвижной фазой и мицеллярной фазой смещается в сторону объема с увеличением концентрации метанола. Для CTAB рост ККМ является наибольшим от 0 до 10% метанола и почти постоянным от 10 до 20%. Выше 20% метанола мицеллы распадаются и не существуют. Для SDS значения CMC остаются неизменными ниже 10% метанола, но начинают увеличиваться по мере дальнейшего увеличения концентрации метанола. Дезагрегация происходит выше 30% метанола. Наконец, для Septonex наблюдается лишь небольшое увеличение CMC до 20%, а дезагрегация происходит выше 25%. ^[7]

Как уже утверждалось, подвижная фаза в MLC состоит из мицелл в водном растворителе, обычно с небольшим количеством органического модификатора, добавленного для завершения подвижной фазы. Используется типичная обращенно-фазовая алкил -связанная неподвижная фаза. Первое обсуждение термодинамики, вовлеченной в механизм удерживания, было опубликовано Армстронгом и Номом в 1981 году. ^[8] В MLC необходимо учитывать три коэффициента распределения . Растворенное вещество будет распределяться между водой и неподвижной фазой (KSW), водой и мицеллами (KMW) и мицеллами и неподвижной фазой (KSM).

Армстронг и Ном вывели уравнение, описывающее коэффициенты распределения в терминах фактора удерживания , формально фактора емкости, k¢. В ВЭЖХ фактор емкости представляет собой молярное отношение растворенного вещества в неподвижной фазе к подвижной фазе. Фактор емкости легко измерить на основе времени удерживания соединения и любого неудерживаемого соединения. Уравнение, переписанное Гермушем и др. ^[9], представлено здесь:

1/k¢ = [n • (KMW-1)/(f • KSW)] • CM +1/(f • KSW)

Где:

• k¢ — коэффициент емкости растворенного вещества
• KSW — коэффициент распределения растворенного вещества между неподвижной фазой и водой.
• KMW — коэффициент распределения растворенного вещества между мицеллами и водой.
• f — отношение объемов фаз (объем неподвижной фазы/объем подвижной фазы)
• n — молярный объем поверхностно-активного вещества
• CM – концентрация мицелл в подвижной фазе (общая концентрация ПАВ – критическая концентрация мицеллообразования)

График 1/k¢ против CM дает прямую линию, в которой KSW может быть рассчитан из отсекаемого значения, а KMW может быть получен из отношения наклона к отсекаемому значению. Наконец, KSM может быть получен из отношения двух других коэффициентов разделения:

КСМ = КСВ/ КМВ ^[8]

Как можно видеть на рисунке 1, KMW не зависит от каких-либо эффектов неподвижной фазы, предполагая ту же самую мицеллярную подвижную фазу. ^[9]

Обоснованность механизма удерживания, предложенного Армстронгом и Номом, была успешно и многократно подтверждена экспериментально. Однако были предложены также некоторые вариации и альтернативные теории. Джандера и Фишер ^[10] разработали уравнения для описания зависимости поведения удерживания от изменения концентрации мицелл. Они обнаружили, что удерживание большинства протестированных соединений уменьшалось с увеличением концентрации мицелл. Из этого можно предположить, что соединения ассоциируются с мицеллами, поскольку они проводят меньше времени в ассоциации с неподвижной фазой. ^[10]

Фоли предложил модель удерживания, похожую на модель Армстронга и Нома, которая была общей моделью для вторичных химических равновесий в жидкостной хроматографии. ^[11] Хотя эта модель была разработана в предыдущей ссылке и могла использоваться для любых вторичных химических равновесий, таких как кислотно-щелочные равновесия и ионное спаривание, Фоли дополнительно уточнил модель для MLC. Когда равновесное вещество (X), в данном случае поверхностно-активное вещество, добавляется к подвижной фазе, создается вторичное равновесие, в котором аналит будет существовать как свободное аналит (A) и в комплексе с равновесным веществом (AX). Две формы будут удерживаться неподвижной фазой в разной степени, что позволяет изменять удерживание путем регулировки концентрации равновесного вещества (мицелл). ^[11]

Полученное уравнение, решенное для коэффициента мощности с точки зрения коэффициентов разделения, во многом похоже на уравнение Армстронга и Нома:

1/k¢ = (КСМ/k¢С) • [М] + 1/k¢С

Где:

• k¢ — коэффициент емкости комплексного растворенного вещества и свободного растворенного вещества
• k¢S — коэффициент емкости свободного растворенного вещества
• KSM — коэффициент распределения растворенного вещества между неподвижной фазой и мицеллой.
• [M] может быть либо концентрацией поверхностно-активного вещества, либо концентрацией мицелл.

Фоли использовал приведенное выше уравнение для определения констант ассоциации растворенного вещества с мицеллами и свободных факторов удерживания растворенного вещества для различных растворенных веществ с различными поверхностно-активными веществами и неподвижными фазами. Из этих данных можно предсказать тип и оптимальные концентрации поверхностно-активного вещества, необходимые для данного растворенного вещества или растворенных веществ. ^[11]

Фоли был не единственным исследователем, заинтересованным в определении констант ассоциации растворенное вещество-мицелла. Обзорная статья Марины и Гарсии с 53 ссылками обсуждает полезность получения констант ассоциации растворенное вещество-мицелла. ^[12] Константы ассоциации для двух растворенных веществ могут быть использованы для понимания механизма удерживания. Фактор разделения двух растворенных веществ, a, может быть выражен как KSM1/KSM2. Если экспериментальный a совпадает с отношением двух коэффициентов распределения растворенное вещество-мицелла, можно предположить, что их удерживание происходит посредством прямого переноса из мицеллярной фазы в неподвижную фазу. Кроме того, расчет a позволит предсказать селективность разделения до проведения анализа, при условии, что два коэффициента известны. ^[12]

Желание предсказать поведение удерживания и селективность привело к разработке нескольких математических моделей. ^[13] Изменения pH, концентрации поверхностно-активного вещества и концентрации органического модификатора играют важную роль в определении хроматографического разделения. Часто один или несколько из этих параметров необходимо оптимизировать для достижения желаемого разделения, однако оптимальные параметры должны учитывать все три переменные одновременно. В обзоре Гарсиа-Альварес-Коке и др. упоминается несколько успешных моделей для различных сценариев, некоторые из которых будут упомянуты здесь. Классические модели Армстронга, Нома и Фоли используются для описания общих случаев. Модель Фоли применима ко многим случаям и была экспериментально проверена для ионных, нейтральных, полярных и неполярных растворенных веществ; анионных, катионных и неионных поверхностно-активных веществ, а также неподвижных фаз C8, C-18 и циано . Модель начинает отклоняться для сильно и слабо удерживаемых растворенных веществ. Высокоудерживаемые растворенные вещества могут необратимо связываться с неподвижной фазой, тогда как низкоудерживаемые растворенные вещества могут элюироваться в свободный объем колонки. ^[13]

Другие модели, предложенные Аруньянартом и Клайн-Лавом, а также Роджерсом и Халеди, описывают влияние pH на удерживание слабых кислот и оснований. Эти авторы вывели уравнения, связывающие pH и концентрацию мицелл с удерживанием. При изменении pH наблюдается сигмоидальное поведение для удерживания кислотных и основных видов. Было показано, что эта модель точно предсказывает поведение удерживания. ^[13] Другие модели предсказывают поведение в гибридных мицеллярных системах, используя уравнения или моделирование поведения на основе контролируемых экспериментов. Кроме того, были предложены модели, учитывающие одновременное влияние pH, концентрации мицелл и органических веществ. Эти модели позволяют дополнительно улучшить оптимизацию разделения слабых кислот и оснований. ^[13]

Одна исследовательская группа, Рухадзе и др. ^[14] вывели линейную зависимость первого порядка, описывающую влияние концентрации мицелл и органических веществ, а также pH на селективность и разрешение семи барбитуратов . Исследователи обнаружили, что математическое уравнение второго порядка будет точнее соответствовать данным. Выводы и экспериментальные детали выходят за рамки этого обсуждения. Модель успешно предсказала экспериментальные условия, необходимые для достижения разделения соединений, которые традиционно трудно разделять. ^[14]

Джандера, Фишер и Эффенбергер подошли к проблеме моделирования еще одним способом. ^[15] Используемая модель была основана на индексах липофильности и полярности растворенных веществ. Индекс липофильности связывает данное растворенное вещество с гипотетическим числом атомов углерода в алкильной цепи. Он основан и зависит от заданной калибровочной серии, определенной экспериментально. Индекс липофильности должен быть независимым от неподвижной фазы и концентрации органического модификатора. Индекс полярности является мерой полярности взаимодействий растворенного вещества и растворителя. Он сильно зависит от органического растворителя и в некоторой степени от полярных групп, присутствующих в неподвижной фазе. 23 соединения были проанализированы с различными подвижными фазами и сравнены с индексами липофильности и полярности. Результаты показали, что модель может быть применена к МЛК, но лучшее предсказательное поведение было обнаружено при концентрациях поверхностно-активного вещества ниже ККМ, субмицеллярных. ^[15]

Последний тип модели, основанный на молекулярных свойствах растворенного вещества, является ветвью количественных соотношений структура-активность (QSAR). Исследования QSAR пытаются сопоставить биологическую активность лекарств или класса лекарств со структурами. Обычно принятый способ поглощения лекарства или его метаболита заключается в разделении на липидные бислои . Дескриптор, наиболее часто используемый в QSAR для определения гидрофобности соединения, - это коэффициент распределения октанол -вода, log P. ^[16] MLC представляет собой привлекательную и практичную альтернативу QSAR. Когда мицеллы добавляются в подвижную фазу, существует много сходств между мицеллярной подвижной фазой/стационарной фазой и интерфейсом биологическая мембрана/вода. В MLC неподвижная фаза модифицируется адсорбцией мономеров поверхностно-активных веществ, которые структурно похожи на мембранные углеводородные цепи в биологической модели. Кроме того, гидрофильные/гидрофобные взаимодействия мицелл аналогичны взаимодействиям в полярных областях мембраны. Таким образом, широкое распространение получила разработка количественных соотношений сохранения структуры (QRAR). ^[17]

Эскудер-Гилаберт и др. ^[18] протестировали три различные модели удержания QRAR на ионных соединениях. Было протестировано несколько классов соединений, включая катехоламины , местные анестетики , диуретики и аминокислоты . Наилучшей моделью, связывающей log K и log P, оказалась та, в которой общий молярный заряд соединения при заданном pH включен в качестве переменной. Эта модель, как оказалось, дает довольно точные прогнозы log P, R  > 0,9. ^[18] Были проведены другие исследования, в которых разрабатывались предиктивные модели QRAR для трициклических антидепрессантов ^[17] и барбитуратов. ^[16]

Основным ограничением в использовании MLC является снижение эффективности (уширение пика), которое наблюдается при использовании чисто водных мицеллярных подвижных фаз. ^[19] Было предложено несколько объяснений низкой эффективности. Плохое смачивание неподвижной фазы мицеллярной водной подвижной фазой, медленный массоперенос между мицеллами и неподвижной фазой и плохой массоперенос внутри неподвижной фазы были постулированы как возможные причины. Для повышения эффективности наиболее распространенными подходами были добавление небольших количеств изопропилового спирта и повышение температуры. Обзор Бертода ^[19] изучил объединенные теории, представленные выше, и применил уравнение Нокса для независимого определения причины снижения эффективности. Уравнение Нокса обычно используется в ВЭЖХ для описания различных вкладов в общее уширение полосы растворенного вещества. Уравнение Нокса выражается как:

ч = А^(1/3)+ В/н + Сн

Где:

• h = приведенное количество высот пластины (высота пластины/диаметр частиц неподвижной фазы)
• n = приведенная линейная скорость подвижной фазы (скорость, умноженная на диаметр частиц неподвижной фазы/коэффициент диффузии растворенного вещества в подвижной фазе)
• A, B и C — константы, связанные с анизотропией потока растворенного вещества (вихревой диффузией), молекулярной продольной диффузией и свойствами массопереноса соответственно.

Использование Бертодом уравнения Нокса для экспериментального определения того, какая из предложенных теорий наиболее верна, привело его к следующим выводам. Анизотропия потока в мицеллярной фазе, по-видимому, намного больше, чем в традиционных гидроорганических подвижных фазах с аналогичной вязкостью . Вероятно, это связано с частичным засорением пор неподвижной фазы адсорбированными молекулами поверхностно-активного вещества. Повышение температуры колонки привело как к снижению вязкости подвижной фазы, так и к уменьшению количества адсорбированного поверхностно-активного вещества. Оба результата уменьшают член A и количество вихревой диффузии , и тем самым повышают эффективность. ^[19]

Увеличение члена B, связанного с продольной диффузией, связано с уменьшением коэффициента диффузии растворенного вещества в подвижной фазе, DM, из-за присутствия мицелл и увеличения коэффициента емкости, k¢. Опять же, это связано с адсорбцией поверхностно-активного вещества на неподвижной фазе, вызывающей резкое уменьшение коэффициента диффузии растворенного вещества в неподвижной фазе, DS. Опять же, увеличение температуры, теперь в сочетании с добавлением спирта в подвижную фазу, резко уменьшает количество поглощенного поверхностно-активного вещества. В свою очередь, оба действия уменьшают член C, вызванный медленным переносом массы из неподвижной фазы в подвижную фазу. Дальнейшая оптимизация эффективности может быть достигнута путем уменьшения скорости потока до скорости, близкой к той, которая получена из уравнения Нокса. В целом, три предложенные теории, по-видимому, внесли свой вклад в наблюдаемую низкую эффективность и могут быть частично нейтрализованы добавлением органических модификаторов, в частности спирта, и повышением температуры колонки. ^[19]

Несмотря на сниженную эффективность по сравнению с обращенно-фазовой ВЭЖХ, сообщалось о сотнях приложений с использованием МЖХ. Одним из наиболее выгодных является возможность прямой инъекции физиологических жидкостей. Мицеллы обладают способностью солюбилизировать белки , что позволяет МЖХ быть полезным при анализе необработанных биологических жидкостей, таких как плазма , сыворотка и моча . ^[1] Мартинес и др. ^[20] обнаружили, что МЖХ очень полезен при анализе класса препаратов, называемых b-антагонистами, так называемыми бета-блокаторами , в образцах мочи. Главное преимущество использования МЖХ с этим типом образца — большая экономия времени на подготовку образца. Альтернативные методы анализа, включая обращенно-фазовую ВЭЖХ, требуют длительных процедур экстракции и обработки образца перед началом анализа. С МЖХ часто возможна прямая инъекция со временем удерживания менее 15 минут для разделения до девяти b-антагонистов. ^[20]

В другом приложении сравнивали обращенно-фазовую ВЭЖХ с МЖХ для анализа десферриоксамина в сыворотке. ^[21] Десферриоксамин (ДФО) — это широко используемый препарат для удаления избытка железа у пациентов с хроническими и острыми уровнями. Анализ ДФО вместе с его хелатированными комплексами, Fe(III) DFO и Al (III) DFO, оказался в лучшем случае сложным в предыдущих попытках. Это исследование показало, что прямая инъекция сыворотки возможна для МЖХ, в отличие от этапа ультрафильтрации, необходимого в ВЭЖХ. Этот анализ показал трудности с разделением хелатированных соединений ДФО и с уровнями чувствительности для самого ДФО при применении МЖХ. Исследователь обнаружил, что в этом случае обращенно-фазовая ВЭЖХ была лучшей, более чувствительной техникой, несмотря на экономию времени при прямой инъекции. ^[21]

Анализ фармацевтических препаратов с помощью МЖХ также набирает популярность. Селективность и форма пика МЖХ по сравнению с обычно используемой ионно-парной хроматографией значительно улучшены. ^[22] МЖХ имитирует, но усиливает селективность, предлагаемую реагентами для ионно-парного разделения активных ингредиентов в фармацевтических препаратах . Для основных препаратов МЖХ устраняет чрезмерное размывание пиков, часто наблюдаемое при ионно-парном разделении. Гидрофильные препараты часто не удерживаются при использовании обычной ВЭЖХ, удерживаются МЖХ из-за солюбилизации в мицеллах. Обычно встречающиеся в лекарствах от простуды препараты, такие как ацетаминофен , L-аскорбиновая кислота , фенилпропаноламин HCL, типепидина хибензат и хлорфенирамин малеат, были успешно разделены с хорошей формой пика с помощью МЖХ. Дополнительные основные препараты, такие как многие наркотики, такие как кодеин и морфин , также были успешно разделены с помощью МЖХ. ^[22]

Другое новое применение MLC включает разделение и анализ неорганических соединений , в основном простых ионов. Это относительно новая область для MLC, но она показала некоторые многообещающие результаты. ^[23] Было замечено, что MLC обеспечивает лучшую селективность неорганических ионов, чем ионообменная или ионно-парная хроматография. Хотя это применение все еще находится на начальных стадиях разработки, существуют возможности для новых, гораздо более совершенных разделений неорганических видов. ^[23]

С тех пор как этот метод был впервые описан в 1980 году, мицеллярная жидкостная хроматография использовалась в сотнях приложений. Этот метод, контролируемый мицеллами, предоставляет уникальные возможности для решения сложных задач разделения. Несмотря на низкую эффективность MLC, он успешно использовался во многих приложениях. Использование MLC в будущем, по-видимому, будет иметь чрезвычайное преимущество в областях физиологических жидкостей, фармацевтических препаратов и даже неорганических ионов. Метод доказал свое превосходство над ионным парным и ионным обменом для многих приложений. Поскольку разрабатываются новые подходы для борьбы с низкой эффективностью MLC, его применение, несомненно, будет распространяться и получать большее признание.