Компартментализация in vitro

Компартментализация in vitro ( IVC ) — это технология на основе эмульсии , которая создает компартменты, подобные клеткам in vitro . Эти компартменты разработаны таким образом, что каждый из них содержит не более одного гена . Когда ген транскрибируется и/или транслируется , его продукты ( РНК и/или белки ) оказываются «запертыми» вместе с кодирующим геном внутри компартмента. Связывая генотип ( ДНК ) и фенотип (РНК, белок), компартментализация позволяет осуществлять отбор и эволюцию фенотипа.

История

Метод компартментализации in vitro был впервые разработан Дэном Тофиком и Эндрю Гриффитсом. [1] Основываясь на идее, что дарвиновская эволюция основана на связи генотипа с фенотипом, Тофик и Гриффитс разработали водные отсеки эмульсий вода-в-масле (w/o) для имитации клеточных отсеков, которые могут связывать генотип и фенотип . Эмульсии клеточных отсеков были сформированы путем добавления in vitro смеси для транскрипции / трансляции к перемешиваемому минеральному маслу, содержащему поверхностно-активные вещества . Средний диаметр капель был измерен и составил 2,6 мкм с помощью лазерной дифракции. В качестве доказательства концепции Тофик и Гриффитс разработали эксперимент по отбору с использованием пула последовательностей ДНК, включая ген, кодирующий ДНК-метилтрансферазу HaeIII (M.HaeIII), в присутствии 10 7 -кратного избытка генов, кодирующих другой фермент folA. 3' каждой последовательности ДНК была специально разработана так, чтобы содержать сайт распознавания HaeIII , который в присутствии экспрессированной метилтрансферазы будет метилирован и, таким образом, устойчив к расщеплению рестриктазой. Отбирая последовательности ДНК, которые выдерживают расщепление эндонуклеазой, Тауфик и Гриффитс обнаружили, что гены M.HaeIII были обогащены по крайней мере в 1000 раз по сравнению с генами folA в первом раунде селекции.

Метод

Сравнение компартментализации клеток in vivo (слева) и компартментализации in vitro (справа) с использованием капель двойной эмульсии и флуоресцентной сортировки .
1) В системе in vivo библиотека генов трансформируется в бактерии для получения вариантов белка и диспергируется в эмульсии вода-в-масле (w/o) с целью того, чтобы каждая капля содержала максимум одну клетку. 2) В системе in vitro клетки не используются, а вместо этого варианты белка производятся посредством транскрипции/трансляции in vitro с целью получения одного гена на каплю. 3,4) В обоих случаях капли затем ресуспендируются в воде для получения эмульсии вода-в-масле-в-воде (w/o/w), добавляют флуорогенный субстрат и пропускают перед лазером и детектором в сортировщике клеток с активацией флуоресценции. Это приводит к тому, что гены, кодирующие активные варианты белка, изолируются и амплифицируются, секвенируются и используются для дальнейших раундов отбора или направленной эволюции. [2]

Эмульсионная технология

Эмульсии вода-в-масле (w/o) создаются путем смешивания водной и масляной фаз с помощью поверхностно-активных веществ. Типичная эмульсия IVC образуется путем первоначального создания смеси масло-ПАВ путем перемешивания, а затем постепенного добавления водной фазы к смеси масло-ПАВ. Для образования стабильной эмульсии необходима смесь ПАВ с HLB (гидрофильно-липофильным балансом) и ПАВ с низким HLB. [3] Некоторые комбинации ПАВ, используемые для создания смеси масло-ПАВ, представляют собой минеральное масло / 0,5% Tween 80 / 4,5% Span 80 / дезоксихолат натрия [1] и более термостабильная версия, легкое минеральное масло / 0,4% Tween 80 / 4,5% Span 80 / 0,05% Triton X-100 . [4] Водная фаза, содержащая компоненты транскрипции и/или трансляции, медленно добавляется к масляным поверхностно-активным веществам, а образование воды в масле облегчается путем гомогенизации, перемешивания или использования ручного экструдера.

Качество эмульсии можно определить с помощью световой микроскопии и/или методов динамического рассеяния света . Эмульсия довольно разнообразна, и более высокие скорости гомогенизации помогают производить более мелкие капли с более узким распределением размеров. Однако скорости гомогенизации необходимо контролировать, поскольку скорость свыше 13 500 об/мин имеет тенденцию приводить к значительной потере активности фермента на уровне транскрипции. Наиболее широко используемое образование эмульсии дает капли со средним диаметром 2-3 мкм и средним объемом ~5 фемтолитров, или 10 10 водных капель на мл эмульсии. [5] Соотношение генов и капель рассчитано таким образом, что большинство капель статистически содержит не более одного гена.

В пробиркетранскрипция/перевод

IVC позволяет миниатюризировать крупномасштабные методы, которые теперь можно реализовать в микромасштабе, включая сопряженные эксперименты по транскрипции и трансляции in vitro (IVTT). Оптимизация и интеграция транскрипции и трансляции позволяет создавать быстрые и высококонтролируемые экспериментальные проекты. [6] [7] [8] IVTT можно проводить как в объемных эмульсиях, так и в микрокаплях с использованием микрофлюидики на основе капель . Микрокапли, капли в масштабе от пико до фемтолитров, успешно использовались в качестве сосудов для одной молекулы ДНК. [9] [10] Эта технология капель обеспечивает высокопроизводительный анализ с множеством различных давлений отбора в одной экспериментальной установке. [6] [10] IVTT в микрокаплях предпочтительнее, когда сверхэкспрессия желаемого белка будет токсичной для клетки-хозяина, сводя к минимуму полезность механизмов транскрипции и трансляции. [11]

IVC использовала бактериальные клетки, экстракты зародышей пшеницы и ретикулоцитов кролика (RRL) для транскрипции и трансляции. Также возможно использовать бактериальную реконструированную систему трансляции, такую ​​как PURE, в которой компоненты трансляции индивидуально очищаются и позже объединяются. При экспрессии эукариотических или сложных белков желательно использовать эукариотические системы трансляции, такие как экстракт зародышей пшеницы или более совершенную альтернативу, экстракт RRL. Чтобы использовать RRL для транскрипции и трансляции, нельзя использовать традиционную формулу эмульсии, поскольку она отменяет трансляцию. Вместо этого была разработана новая формула эмульсии: 4% Abil EM90 / легкое минеральное масло, которая продемонстрировала свою функциональность в экспрессии люциферазы и человеческой теломеразы . [12]

Разрушение эмульсии и соединение генотипа и фенотипа

После завершения транскрипции и/или трансляции в каплях эмульсия будет разрушена последовательными этапами удаления минерального масла и поверхностно-активных веществ для обеспечения последующего отбора. На этом этапе крайне важно иметь метод «отслеживания» каждого генного продукта до кодирующего гена, поскольку они становятся свободно плавающими в гетерогенной популяции молекул. Существует три основных подхода к отслеживанию каждого фенотипа до его генотипа. [13] Первый метод заключается в присоединении каждой молекулы ДНК с группой биотина и дополнительной кодирующей последовательностью для стрептавидина (STABLE display). [14] Все вновь образованные белки/пептиды будут находиться в слиянии с молекулами стрептавидина и связываться с их биотинилированной кодирующей последовательностью. Улучшенная версия присоединяла две молекулы биотина к концам молекулы ДНК для увеличения авидности между молекулой ДНК и слитыми со стрептавидином пептидами и использовала синтетический ген стрептавидина с низким содержанием GC для повышения эффективности и специфичности во время ПЦР-амплификации. [15] Второй метод заключается в ковалентном связывании ДНК и белка. Были продемонстрированы две стратегии. Первая заключается в формировании белков слияния M.HaeIII. [16] Каждый экспрессируемый белок/полипептид будет находиться в слиянии с доменом ДНК-метилтрансферазы Hae III, который способен ковалентно связываться с фрагментами ДНК, содержащими последовательность 5′-GGC*-3′, где C* — это 5-фтор-2-дезоксицитидин. Вторая стратегия заключается в использовании мономерного мутанта фермента VirD2. [17] Когда белок/пептид экспрессируется в слиянии с белком Agrobacterium VirD2, он будет связываться с его кодирующей последовательностью ДНК, которая имеет одноцепочечный выступ, включающий последовательности распознавания T-границы VirD2. Третий метод заключается в связывании фенотипа и генотипа с помощью бусин. [18] Используемые бусины будут покрыты стрептавидином, что позволит связывать биотинилированную ДНК, кроме того, бусины также будут отображать родственный связывающий партнер для аффинной метки , которая будет экспрессироваться при слиянии с белком/пептидом.

Выбор

В зависимости от фенотипа, который будет выбран, будут использоваться стратегии отбора различий. Стратегию отбора можно разделить на три основные категории: отбор для связывания, отбор для катализа и отбор для регуляции. [19] Выбираемый фенотип может варьироваться от РНК до пептида и белка. При выборе для связывания наиболее часто развиваются фенотипы пептидов/белков, которые имеют селективное сродство к определенному антителу или молекуле ДНК. Примером является отбор белков, которые имеют сродство к ДНК цинкового пальца , проведенный Сеппом и др. [20] При выборе каталитических белков/РНК обычно выделяют новые варианты с новыми или улучшенными ферментативными свойствами. Например, были отобраны новые варианты рибозима с транслигазной активностью, которые продемонстрировали множественные обороты. [21] При выборе для регуляции могут быть отобраны ингибиторы ДНК-нуклеаз, такие как белковые ингибиторы ДНКазы колицина E7. [22]

Преимущества

По сравнению с другими технологиями отображения in vitro , IVC имеет два основных преимущества. Первое преимущество заключается в его способности контролировать реакции внутри капель. Гидрофобные и гидрофильные компоненты могут быть доставлены в каждую каплю поэтапно, не нарушая химическую целостность капли, и, таким образом, контролируя, что и когда добавлять, контролируется реакция в каждой капле. Кроме того, в зависимости от характера реакции, которую необходимо провести, pH каждой капли также может быть изменен. Совсем недавно использовались фотоклеточные субстраты, и их участие в реакции регулировалось фотоактивацией. [19] Второе преимущество заключается в том, что IVC позволяет выбирать каталитические молекулы. Например, Гриффитс и др. смогли выбрать варианты фосфотриэстеразы с более высоким K cat путем обнаружения образования и количества продукта с использованием антитела к продукту и проточной цитометрии соответственно. [23]

Ссылки

  1. ^ ab Tawfik DS, Griffiths AD (июль 1998 г.). «Созданное человеком клеточноподобное пространство для молекулярной эволюции». Nature Biotechnology . 16 (7): 652– 6. doi :10.1038/nbt0798-652. PMID  9661199. S2CID  25527137.
  2. ^ Ferrer M, Beloqui A, Vieites JM, Guazzaroni ME, Berger I, Aharoni A (январь 2009 г.). «Взаимодействие метагеномики и компартментализации in vitro». Microbial Biotechnology . 2 (1): 31– 9. doi :10.1111/j.1751-7915.2008.00057.x. PMC 3815420 . PMID  21261880. 
  3. ^ Rothe A, Surjadi RN, Power BE (декабрь 2006 г.). «Новые белки в эмульсиях с использованием компартментализации in vitro». Trends in Biotechnology . 24 (12): 587–92 . doi :10.1016/j.tibtech.2006.10.007. PMID  17055094.
  4. ^ Ghadessy FJ, Ong JL, Holliger P (апрель 2001 г.). «Направленная эволюция функции полимеразы путем компартментализированной саморепликации». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 98 (8): 4552– 7. Bibcode :2001PNAS...98.4552G. doi : 10.1073/pnas.071052198 . PMC 31872. PMID  11274352 . 
  5. ^ Миллер О.Дж., Бернат К., Агрести Дж.Дж., Амитай Дж., Келли Б.Т., Мастробаттиста Э., Тали В., Магдасси С., Тауфик Д.С., Гриффитс А.Д. (июль 2006 г.). «Направленная эволюция путем компартментализации in vitro». Природные методы . 3 (7): 561–70 . doi : 10.1038/nmeth897. PMID  16791215. S2CID  14125396.
  6. ^ ab Castro-Roa D, Zenkin N (сентябрь 2015 г.). «Методология анализа транскрипции и трансляции в системах, сопряженных с транскрипцией и трансляцией in vitro». Методы . 86 : 51– 9. doi : 10.1016/j.ymeth.2015.05.029 . PMID  26080048.
  7. ^ Luke CJ (февраль 2004 г.). «Производство серпина с использованием быстрых систем транскрипции/трансляции in vitro». Методы . 32 (2): 191– 8. doi :10.1016/s1046-2023(03)00211-1. PMID  14698632.
  8. ^ Theberge AB, Courtois F, Schaerli Y, Fischlechner M, Abell C, Hollfelder F, Huck WT (август 2010 г.). «Микрокапли в микрофлюидике: развивающаяся платформа для открытий в химии и биологии» (PDF) . Angewandte Chemie . 49 (34): 5846– 68. doi :10.1002/anie.200906653. PMID  20572214.
  9. ^ Kintses B, van Vliet LD, Devenish SR, Hollfelder F (октябрь 2010 г.). «Микрожидкостные капли: новые интегрированные рабочие процессы для биологических экспериментов». Current Opinion in Chemical Biology . 14 (5): 548–55 . doi :10.1016/j.cbpa.2010.08.013. PMID  20869904.
  10. ^ ab Courtois F, Olguin LF, Whyte G, Bratton D, Huck WT, Abell C, Hollfelder F (февраль 2008 г.). «Интегрированное устройство для мониторинга зависящей от времени экспрессии in vitro из отдельных генов в пиколитровых каплях». ChemBioChem . 9 (3): 439– 46. doi :10.1002/cbic.200700536. PMID  18232037. S2CID  8684268.
  11. ^ Colin PY, Zinchenko A, Hollfelder F (август 2015). «Инженерия ферментов в биомиметических отсеках». Current Opinion in Structural Biology . 33 : 42–51 . doi :10.1016/j.sbi.2015.06.001. PMID  26311177.
  12. ^ Ghadessy FJ, Holliger P (март 2004). «Новая эмульсионная смесь для in vitro компартментализации транскрипции и трансляции в системе ретикулоцитов кролика». Protein Engineering, Design & Selection . 17 (3): 201– 4. doi : 10.1093/protein/gzh025 . PMID  14990785.
  13. ^ Leemhuis H, Stein V, Griffiths AD, Hollfelder F (август 2005 г.). «Новые связи генотипа и фенотипа для направленной эволюции функциональных белков». Current Opinion in Structural Biology . 15 (4): 472– 8. doi :10.1016/j.sbi.2005.07.006. PMID  16043338.
  14. ^ Yonezawa M, Doi N, Higashinakagawa T, Yanagawa H (март 2004 г.). «ДНК-дисплей биологически активных белков для отбора белков in vitro». Журнал биохимии . 135 (3): 285– 8. doi :10.1093/jb/mvh034. PMID  15113826.
  15. ^ Yonezawa M, Doi N, Kawahashi Y, Higashinakagawa T, Yanagawa H (октябрь 2003 г.). «Дисплей ДНК для in vitro отбора различных пептидных библиотек». Nucleic Acids Research . 31 (19): 118e–118. doi :10.1093/nar/gng119. PMC 206484. PMID  14500846 . 
  16. ^ Bertschinger J, Neri D (сентябрь 2004 г.). «Отображение ковалентной ДНК как новый инструмент для направленной эволюции белков in vitro». Protein Engineering, Design & Selection . 17 (9): 699–707 . doi : 10.1093/protein/gzh082 . hdl : 20.500.11850/34052 . PMID  15522920.
  17. ^ de Figueiredo P, Roberts RL, Nester EW (октябрь 2004 г.). «DARTs: технология отображения полипептидов in vitro на основе ДНК». Proteomics . 4 (10): 3128– 40. doi :10.1002/pmic.200300842. PMID  15378701. S2CID  24348103.
  18. ^ Nord O, Uhlén M, Nygren PA (декабрь 2003 г.). «Микробусное отображение белков с помощью бесклеточной экспрессии закрепленной ДНК». Журнал биотехнологии . 106 (1): 1– 13. doi :10.1016/j.jbiotec.2003.09.002. PMID  14636705.
  19. ^ ab Griffiths AD, Tawfik DS (сентябрь 2006 г.). «Миниатюризация лаборатории в эмульсионных каплях». Тенденции в биотехнологии . 24 (9): 395– 402. doi :10.1016/j.tibtech.2006.06.009. PMID  16843558.
  20. ^ Sepp A, Choo Y (ноябрь 2005 г.). «Бесклеточный отбор ДНК-связывающих белков с цинковыми пальцами с использованием компартментализации in vitro». Журнал молекулярной биологии . 354 (2): 212– 9. doi :10.1016/j.jmb.2005.09.051. PMID  16242713.
  21. ^ Levy M, Griswold KE, Ellington AD (октябрь 2005 г.). «Прямой выбор транс-действующих лигазных рибозимов путем компартментализации in vitro». РНК . 11 (10): 1555– 62. doi :10.1261/rna.2121705. PMC 1370839. PMID  16131588 . 
  22. ^ Бернат К, Магдасси С, Тауфик Д.С. (февраль 2005 г.). «Направленная эволюция белковых ингибиторов ДНК-нуклеаз путем компартментализации in vitro (IVC) и доставки нанокапель». Журнал молекулярной биологии . 345 (5): 1015–26 . doi :10.1016/j.jmb.2004.11.017. PMID  15644201.
  23. ^ Griffiths AD, Tawfik DS (январь 2003 г.). «Направленная эволюция чрезвычайно быстрой фосфотриэстеразы путем компартментализации in vitro». The EMBO Journal . 22 (1): 24–35 . doi :10.1093/emboj/cdg014. PMC 140064. PMID  12505981. 
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=In_vitro_compartmentalization&oldid=1193599492"