FepA

Многие бактерии секретируют небольшие связывающие железо молекулы, называемые сидерофорами , которые прочно связываются с ионами трехвалентного железа . FepA — это интегральный белок внешней мембраны бактерий , который принадлежит к семейству рецепторов внешней мембраны и обеспечивает активный транспорт железа, связанного сидерофором энтеробактином , из внеклеточного пространства в периплазму грамотрицательных бактерий . Было также показано, что FepA транспортирует витамин B12 , а также колицины B и D. ^[1] Этот белок принадлежит к семейству лиганд-управляемых белковых каналов .

Поскольку энергия напрямую не доступна для внешней мембраны, энергия для перемещения железо-энтеробактина FepA возникает из протонной движущей силы ( электрохимического градиента ), генерируемой внутренним мембранным комплексом TonB–ExbB–ExbD. Эта сила физически передается FepA через прямое взаимодействие между FepA и TonB .

С помощью рентгеновской кристаллографии было обнаружено, что структура FepA представляет собой 724- остатковую 22-цепочечную β-бочку . Внеклеточная сторона бочки содержит петли, которые действуют как высокоаффинные и высокоспецифичные лиганд-связывающие сайты для железного энтеробактина. N-конец образует меньший домен-заглушку внутри гидрофильного ствола, эффективно закрывая пору. Исследования FhuA, похожего TonB -зависимого внешнего мембранного транспортера, показывают, что взаимодействие домена N-конца с внутренними стенками поры усиливается девятью солевыми мостиками и более чем 60 водородными связями. N-конец также имеет две внеклеточные петли в поре, которые, как полагают, способствуют передаче сигнала между связыванием лиганда и TonB-опосредованным транспортом, хотя точный механизм не ясен. Остатки 12–18 N-концевого домена FepA составляют область, называемую TonB-боксом, которая включает по крайней мере остаток пролина и глицина. ^{[2] [3]}

Энтеробактин представляет собой циклический триэфир 2,3-дигидроксибензоилсерина с молекулярной массой 719 Да . Он связывает ионы железа, используя шесть атомов кислорода из трех катехольных групп, что дает общий заряд −3. Как и связывающий катехол , энтеробактин , как полагают, также имеет тройную симметрию, рассекающую металлический центр. ^[4]

Железо обычно не легкодоступно в среде, в которой находится эта группа бактерий. Однако железо необходимо для поддержания жизни из-за его роли в коферментах дыхания и синтезе ДНК, поэтому бактерии должны адаптироваться, чтобы иметь механизм для потребления железа. Поскольку Fe ³⁺ имеет очень низкую растворимость, большинство ионов Fe ³⁺ в окружающей среде бактерий (например, почве) существуют в виде оксидов или гидроксидов железа, и поэтому количество свободного Fe ³⁺ невелико. Поэтому микробы эволюционировали, чтобы секретировать сидерофоры , пептиды, связывающие Fe ³⁺ , в окружающую среду, а затем активно транспортировать комплекс Fe ³⁺ обратно в клетку с помощью активного транспорта . Это также можно увидеть у патогенных бактерий внутри их хозяина, где железо прочно связано гемоглобином , трансферрином , лактоферрином и ферритином , и, таким образом, имеет низкую концентрацию (10 ⁻²⁴ моль л ⁻¹ ). Здесь он секретирует сидерофоры, которые имеют более высокое сродство (с константой образования, или ([ML])/([M][L]), 10 ⁴⁹ ) к Fe ³⁺ , чем железосвязывающие белки хозяина, и поэтому будут удалять железо, а затем транспортировать его внутрь клетки. Bacillus anthracis , грамположительная бактерия ^[5], вызывающая сибирскую язву , секретирует два сидерофора: бациллибактин и петробактин . Escherichia coli секретирует множество транспортов железо-сидерофоров, но производит только один сидерофор — энтеробактин. Рецептор энтеробактина железа FepA распознает катехолатную часть энтеробактина железа (FeEnt) и транспортирует ее через наружную мембрану из внеклеточного пространства в периплазму. Предполагается, что связывание происходит в две фазы ^[6]: быстрый шаг, на котором распознается FeEnt, и более медленный шаг, который может быть первым шагом в транслокации — подготовкой комплекса к транслокации. Оба шага происходят независимо от комплекса TonB–ExbB–ExbD и протонной движущей силы, которую он обеспечивает. В периплазме FeEnt связывается с FepB и передается к интегральным белкам внутренней мембраны FepG и FepD посредством активного транспорта, при этом энергия обеспечивается гидролизом АТФ, катализируемым цитоплазматическим FepC. В цитоплазме эстераза энтеробактина Fes гидролизует, и это расщепляет энтеробактин, высвобождая Fe ³⁺ , который впоследствии будет восстановлен тем же белком, Fes, до Fe ²⁺ .

Когда энтеробактин связывает трехвалентное железо, это изменяет трехмерную конформацию молекулы и изменяет заряд с нейтрального на отрицательный 3. Сайт связывания FepA, образованный внеклеточными петлями, состоит из положительно заряженных аминокислот. ^{[7] [8]} Сочетание специфичности заряда и ограничения размера ствола делает импорт FepA высокоспецифичным для трехвалентного энтеробактина.

Механизм транспорта был описан как аналогичный воздушному затвору. Когда лиганд связан, предполагается, что он закрывает пору на внеклеточной стороне, тем самым предотвращая выход чего-либо через пору. Затем FepA взаимодействует с TonB через консенсусную последовательность из 5 аминокислот, что вызывает изменение N-конца, открывая канал на периплазматическую сторону. ^[9] Это позволило бы FepA транспортировать железо-энтеробактин, не позволяя ионам и малым молекулам проходить в любом направлении.

Когда лиганд связывается с FepA, конформация N-концевого домена изменяется таким образом, чтобы открыть пору. Существуют разногласия относительно того, как открывается пространство внутри ствола, чтобы позволить лиганду пройти. Либо домен N-концевой пробки остается внутри ствола и претерпевает конформационные изменения, чтобы создать пору, либо он временно выпадает из ствола. Была выдвинута гипотеза, что энергетически бессмысленно удалять весь N-концевой домен для транслокации, поскольку это требует разрыва солевых мостиков и многочисленных водородных связей, однако, поскольку ствол заполнен водой, требуемая энергия будет намного меньше, чем считалось ранее. ^[7]

Роль N-конца раскрывается с помощью делеционной мутации N-концевой заглушки; белок все еще может быть вставлен в мембрану, но действует как неселективная пора для более крупных молекул, что проявляется в повышенной проницаемости клетки для мальтотетраозы , мальтопентаозы, феррихрома , а также нескольких антибиотиков, включая альбомицин , ванкомицин и бацитрацин . Однако к этому следует относиться с осторожностью, поскольку конформация ствола может измениться при отсутствии N-концевой заглушки.