Библиотека химических веществ, закодированных в ДНК

Химические библиотеки, кодируемые ДНК ( DECL ), — это технология синтеза и скрининга в беспрецедентном масштабе коллекций низкомолекулярных соединений. DECL используется в медицинской химии для соединения областей комбинаторной химии и молекулярной биологии . Целью технологии DECL является ускорение процесса открытия лекарств и, в частности, деятельности по открытию на ранней стадии, такой как валидация мишеней и идентификация попаданий.

Технология DECL включает в себя конъюгацию химических соединений или строительных блоков с короткими фрагментами ДНК , которые служат идентификационными штрих-кодами и в некоторых случаях также направляют и контролируют химический синтез. Эта технология позволяет массово создавать и исследовать библиотеки с помощью аффинного отбора, как правило, на иммобилизованной белковой мишени. Недавно был разработан гомогенный метод скрининга ДНК-кодируемых библиотек (DEL), который использует технологию эмульсии вода-в-масле для выделения, подсчета и идентификации отдельных комплексов лиганд-мишень в однопробирочном подходе. В отличие от обычных процедур скрининга, таких как высокопроизводительный скрининг , биохимические анализы не требуются для идентификации связующего вещества, что в принципе позволяет изолировать связующие вещества для широкого спектра белков, с которыми исторически трудно справиться с помощью обычных технологий скрининга. Таким образом, в дополнение к общему открытию целевых молекулярных соединений, доступность связующих веществ для фармакологически важных, но пока «не поддающихся лечению» целевых белков открывает новые возможности для разработки новых лекарств от заболеваний, которые до сих пор не поддавались лечению. При устранении необходимости первоначальной оценки активности хитов есть надежда и ожидается, что многие из идентифицированных высокоаффинных связывающих веществ покажут свою активность в независимом анализе выбранных хитов, тем самым предлагая эффективный метод определения высококачественных хитов и фармацевтических лидов.

Химические библиотеки и технологии отображения, закодированные в ДНК

До недавнего времени применение молекулярной эволюции в лабораторных условиях ограничивалось технологиями отображения, включающими биологические молекулы, где открытие малых молекул считалось выходящим за рамки этого биологического подхода. DEL открыли область технологии отображения, включив неприродные соединения, такие как малые молекулы, расширив применение молекулярной эволюции и естественного отбора для идентификации соединений малых молекул с желаемой активностью и функцией. Библиотеки химических веществ, кодируемых ДНК, имеют сходство с технологиями биологического отображения, такими как технология отображения фагов антител , дисплей дрожжей , дисплей мРНК и аптамер SELEX . В фаговом отображении антитела физически связаны с фаговыми частицами, которые несут ген, кодирующий прикрепленное антитело, что эквивалентно физической связи «фенотипа » (белка) и « генотипа » (гена, кодирующего белок). [1] Антитела, отображаемые фагом, могут быть выделены из больших библиотек антител путем имитации молекулярной эволюции : через раунды отбора (на иммобилизованной белковой мишени), амплификации и трансляции. [2] В DEL связь небольшой молекулы с идентификационным кодом ДНК позволяет легко идентифицировать связывающие молекулы. DEL подвергаются процедурам аффинного отбора на иммобилизованном целевом белке по выбору, после чего несвязывающие вещества удаляются этапами промывки, а связывающие вещества впоследствии могут быть амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и идентифицированы на основании их кода ДНК (например, секвенированием ДНК). В основанных на эволюции технологиях DEL хиты могут быть дополнительно обогащены путем выполнения раундов отбора, ПЦР-амплификации и трансляции по аналогии с биологическими системами отображения, такими как отображение фагов антител. Это позволяет работать с гораздо большими библиотеками.

История

«Синтезировать многокомпонентную смесь соединений в одном процессе и также экранировать ее в одном процессе». Это принцип комбинаторной химии, изобретенный профессором Фуркой А. (Университет Этвеша Лоранда, Будапешт, Венгрия) в 1982 году, и описанный им, включая метод синтеза комбинаторных библиотек и метод деконволюции, в документе, заверенном в том же году. [3] Мотивы, которые привели к изобретению, были опубликованы в 2002 году . [4] Химические библиотеки, кодируемые ДНК (DECL), синтезируются по принципу комбинаторной химии, и это явно согласуется с их применением. [5]

Рис. 1 ДНК-кодированная библиотека, отображающая химические соединения Схематическое изображение ДНК-кодированной библиотеки, отображающей химические соединения, непосредственно присоединенные к олигонуклеотидам. а) Библиотека, созданная путем «пошаговой комбинаторной» сборки, представляющая один олигонуклеотид, ковалентно связанный с предполагаемой связывающей молекулой. б) Библиотека построена в режиме «комбинаторной самосборки» ( E ncoded S elf- Assembling C hemical library ). Несколько парных олигонуклеотидов отображают ковалентно связанную связывающую молекулу

Концепция ДНК-кодирования была впервые описана в теоретической статье Сиднея Бреннера и Ричарда Лернера в 1992 году, в которой было предложено связать каждую молекулу химически синтезированного объекта с определенной последовательностью олигонуклеотидов , сконструированной параллельно, и использовать эту кодирующую генетическую метку для идентификации и обогащения активных соединений. [6] В 1993 году первая практическая реализация этого подхода была представлена ​​Дж. Нильсеном, С. Бреннером и К. Джанда, а также группой М. А. Галлопа. [7] [8] Бреннер и Джанда предложили генерировать отдельные кодируемые элементы библиотеки путем чередующегося параллельного комбинаторного синтеза гетерополимерного химического соединения и соответствующей олигонуклеотидной последовательности на одной и той же бусине в режиме «split-&-pool» (см. ниже). [7]

Поскольку незащищенная ДНК ограничена узким окном обычных условий реакции, до конца 1990-х годов был предусмотрен ряд альтернативных стратегий кодирования (например, маркировка соединений на основе MS , кодирование пептидов , галоидароматическая маркировка, кодирование вторичными аминами , полупроводниковые устройства), в основном для того, чтобы избежать неудобного твердофазного синтеза ДНК и создать легко скринируемые комбинаторные библиотеки в высокопроизводительном режиме. [9] Однако избирательная амплифицируемость ДНК значительно облегчает скрининг библиотек, и она становится незаменимой для кодирования библиотек органических соединений такого беспрецедентного размера. Следовательно, в начале 2000-х годов ДНК-комбинаторная химия пережила возрождение.

В начале тысячелетия было представлено несколько независимых разработок в области технологии DEL. Эти технологии можно разделить на две общие категории: не основанные на эволюции и основанные на эволюции технологии DEL, способные к молекулярной эволюции . Первая категория выигрывает от возможности использовать готовые реагенты и, следовательно, позволяет довольно просто генерировать библиотеки. Хиты могут быть идентифицированы с помощью секвенирования ДНК, однако трансляция ДНК и, следовательно, молекулярная эволюция невозможны с помощью этих методов. Подходы разделения и объединения, разработанные исследователями из Praecis Pharmaceuticals (теперь принадлежит GlaxoSmithKline), Nuevolution (Копенгаген, Дания) и технология кодированной самосборки химических веществ (ESAC), разработанная в лаборатории профессора Д. Нери (Институт фармацевтических наук, Цюрих, Швейцария), попадают в эту категорию. Технология ESAC выделяется тем, что представляет собой комбинаторный подход к самосборке, который напоминает обнаружение хитов на основе фрагментов (рис. 1b). Здесь отжиг ДНК позволяет отбирать дискретные комбинации строительных блоков, но между ними не происходит никакой химической реакции. Примерами технологий DEL на основе эволюции являются ДНК-маршрутизация, разработанная профессором DR Halpin и профессором PB Harbury (Стэнфордский университет, Стэнфорд, Калифорния), синтез на основе ДНК, разработанный профессором D. Liu (Гарвардский университет, Кембридж, Массачусетс) и коммерциализированный Ensemble Therapeutics (Кембридж, Массачусетс), и технология YoctoReactor. [10] разработанная и коммерциализированная Vipergen (Копенгаген, Дания). Эти технологии более подробно описаны ниже. Синтез на основе ДНК и технология YoctoReactor требуют предварительной конъюгации химических строительных блоков (BB) с ДНК-олигонуклеотидной меткой перед сборкой библиотеки, поэтому перед сборкой библиотеки требуется больше предварительной работы. Более того, BB с ДНК-метками позволяют генерировать генетический код для синтезированных соединений, и возможна искусственная трансляция генетического кода: то есть BB могут быть вызваны генетическим кодом, амплифицированным ПЦР, и библиотечные соединения могут быть регенерированы. Это, в свою очередь, позволяет применять принцип дарвиновского естественного отбора и эволюции к отбору малых молекул по прямой аналогии с биологическими системами отображения; через раунды отбора, амплификации и трансляции.

Технологии, не основанные на эволюции

Комбинаторные библиотеки

Комбинаторные библиотеки — это специальные многокомпонентные смеси соединений, которые синтезируются в одном поэтапном процессе. Они отличаются как от коллекции индивидуальных соединений, так и от серии соединений, полученных параллельным синтезом. Комбинаторные библиотеки обладают важными особенностями.

″ В их синтезе используются смеси. Использование смесей обеспечивает очень высокую эффективность процесса. Оба реагента могут быть смесями, но по практическим соображениям используется процедура разделения-смешивания: одна смесь делится на части, которые соединяются с ББ. [11] [12] Смеси настолько важны, что не существует комбинаторной библиотеки без использования смеси в синтезе, а если смесь используется в процессе, неизбежно образуются комбинаторные библиотеки.

″ Компоненты библиотек должны присутствовать в почти равных молярных количествах. Чтобы достичь этого как можно точнее, смеси делятся на равные порции, и после объединения необходимо тщательное перемешивание.

″ Поскольку структура компонентов неизвестна, при скрининге необходимо использовать методы деконволюции. По этой причине были разработаны методы кодирования. Кодирующие молекулы прикрепляются к бусинам твердого носителя, которые регистрируют связанные BB и их последовательность. Одним из таких методов является кодирование с помощью олигомеров ДНК.

″ Замечательной особенностью комбинаторных библиотек является то, что всю смесь соединений можно проанализировать за один процесс.

Поскольку и синтез, и скрининг являются очень эффективными процедурами, использование комбинаторных библиотек в фармацевтических исследованиях приводит к огромной экономии.

В твердофазном комбинаторном синтезе в каждой бусине образуется только одно соединение. По этой причине количество компонентов в библиотеке не может превышать количество бусин твердой подложки. Это означает, что количество компонентов в таких библиотеках ограничено. Это ограничение было устранено Харбери и Хэлпином. В их синтезе DEL твердая подложка опущена, а BB присоединены непосредственно к кодирующим ДНК-олигомерам. [13] Этот новый подход помогает практически неограниченно увеличить количество компонентов ДНК-кодируемых комбинаторных библиотек (DECL).

Разделение и объединение кодирования ДНК

Для того чтобы применить комбинаторную химию для синтеза химических библиотек, кодируемых ДНК, был использован подход Split-&-Pool. [11] [12] Первоначально набор уникальных ДНК- олигонуклеотидов ( n ), каждый из которых содержит определенную кодирующую последовательность, химически конъюгируется с соответствующим набором небольших органических молекул. Следовательно, соединения олигонуклеотид -конъюгатов смешиваются («Pool») и разделяются («Split») на несколько групп ( m ). В соответствующих условиях второй набор строительных блоков (m) соединяется с первым, и еще один олигонуклеотид , кодирующий вторую модификацию, ферментативно вводится перед повторным смешиванием. Эти шаги «split-&-pool» можно повторять несколько раз ( r ), увеличивая на каждом раунде размер библиотеки комбинаторным образом (т. е. ( n x m ) r ). В качестве альтернативы, пептидные нуклеиновые кислоты использовались для кодирования библиотек, подготовленных методом «split-&-pool». [14] Преимущество PNA-кодирования заключается в том, что химию можно выполнять с помощью стандартного SPPS. [15]

Поэтапное связывание кодирующих фрагментов ДНК с зарождающимися органическими молекулами

Рис. 3 Библиотека ДНК-кодирования, полученная путем пошагового связывания фрагментов кодирующей ДНК с зарождающимися органическими молекулами методом «Split-&-Pool». Начальный набор многофункциональных строительных блоков (FGn представляет собой различные ортогональные функциональные группы) ковалентно конъюгируется с соответствующим кодирующим олигонуклеотидом и реагирует способом split-&-pool на определенной функциональной группе (FG1 красного цвета) с подходящим набором реагентов. После ферментативного кодирования инициируется еще один раунд split-&-pool. На этом этапе вторая функциональная группа (FG2 синего цвета) проходит дополнительный этап реакции с другим набором подходящих реагентов. Идентичность окончательной модификации может быть снова обеспечена ферментативным кодированием ДНК с помощью дополнительного олигонуклеотида, несущего определенную кодирующую область.

Перспективная стратегия построения ДНК-кодируемых библиотек представлена ​​использованием многофункциональных строительных блоков, ковалентно конъюгированных с олигонуклеотидом, служащим «основной структурой» для синтеза библиотеки. В режиме «пул-и-сплит» набор многофункциональных каркасов подвергается ортогональным реакциям с серией подходящих реактивных партнеров. После каждого этапа реакции идентичность модификации кодируется ферментативным добавлением сегмента ДНК к исходной «основной структуре» ДНК. [16] [17] Использование N -защищенных аминокислот, ковалентно присоединенных к фрагменту ДНК, позволяет после подходящего этапа снятия защиты дополнительно образовать амидную связь с серией карбоновых кислот или провести восстановительное аминирование с альдегидами . Аналогично диеновые карбоновые кислоты, используемые в качестве каркасов для построения библиотеки на 5'-конце аминомодифицированного олигонуклеотида , могут быть подвергнуты реакции Дильса-Альдера с различными производными малеимида . После завершения желаемого этапа реакции идентичность химического фрагмента, добавленного к олигонуклеотиду, устанавливается путем отжига частично комплементарного олигонуклеотида и последующей ДНК-полимеризации Кленова , что дает двухцепочечный фрагмент ДНК. Синтетические и кодирующие стратегии, описанные выше, позволяют легко конструировать ДНК-кодируемые библиотеки размером до 10 4 соединений-членов, несущих два набора «строительных блоков». Однако также можно предусмотреть поэтапное добавление по крайней мере трех независимых наборов химических фрагментов к трехфункциональному основному строительному блоку для конструирования и кодирования очень большой ДНК-кодируемой библиотеки (включающей до 10 6 соединений). [16] ( Рис.2 )

Комбинаторная самосборка

Закодированные самоорганизующиеся химические библиотеки

Рис. 4 Обзор технологии библиотеки ESAC Небольшие органические молекулы связаны с 5'-амино модифицированными олигонуклеотидами, содержащими домен гибридизации и уникальную кодирующую последовательность, которые обеспечивают идентичность связанной молекулы. Библиотека ESAC может использоваться в формате одного фармакофора (a), в созреваниях аффинности известных связующих веществ (b) или в de novo отборах связывающих молекул путем самосборки подбиблиотек в формате двухцепочечной ДНК (c), а также в ДНК-триплексах (d). Библиотека ESAC в выбранном формате используется в процедуре отбора и считывания (e). После инкубации библиотеки (i) с выбранным целевым белком (ii) и промывки несвязанных молекул (iii) олигонуклеотидные коды связывающих соединений амплифицируются ПЦР и сравниваются с библиотекой без отбора на микроматрицах олигонуклеотидов (iv, v). Идентифицированные связующие вещества/связывающие пары проверяются после конъюгации (при необходимости) с подходящими каркасами (vi).

Библиотеки Encoded Self - Assembling C hemical ( ESAC ) основаны на принципе, что две подбиблиотеки размером x членов (например, 10 3 ), содержащие постоянный комплементарный домен гибридизации , могут дать комбинаторную ДНК-дуплексную библиотеку после гибридизации со сложностью x 2 равномерно представленных членов библиотеки (например, 10 6 ). [18] Каждый член подбиблиотеки будет состоять из олигонуклеотида , содержащего вариабельную кодирующую область, фланкированную постоянной последовательностью ДНК, несущей подходящую химическую модификацию на конце олигонуклеотида. [18] Подбиблиотеки ESAC могут использоваться по крайней мере в четырех различных вариантах. [18]

  • Подбиблиотеку можно объединить с комплементарным олигонуклеотидом и использовать в качестве библиотеки, кодируемой ДНК, отображающей одно ковалентно связанное соединение для экспериментов по отбору на основе аффинности.
  • Подбиблиотеку можно объединить с олигонуклеотидом, демонстрирующим известное связывание с мишенью, что позволяет реализовать стратегии созревания сродства.
  • Две отдельные подбиблиотеки могут быть собраны комбинаторно и использованы для идентификации de novo бидентатных связывающих молекул.
  • Три различные подбиблиотеки могут быть объединены в комбинаторную триплексную библиотеку.

Предпочтительные связующие, выделенные из отбора на основе аффинности, могут быть амплифицированы ПЦР и декодированы на комплементарных олигонуклеотидных микроматрицах [19] или путем конкатенации кодов, субклонирования и секвенирования . [18] Отдельные строительные блоки в конечном итоге могут быть конъюгированы с использованием подходящих линкеров для получения лекарственно-подобного высокоаффинного соединения. Характеристики линкера (например, длина, гибкость, геометрия, химическая природа и растворимость) влияют на связывающую аффинность и химические свойства полученного связующего. ( Рис.3 )

Эксперименты по биопаннингу на HSA библиотеки ESAC из 600 членов позволили выделить 4-( p -иодофенил)бутановую часть. Соединение представляет собой основную структуру серии переносимых молекул, связывающих альбумин , и Albufluor, недавно разработанного флуоресцеинового ангиографического контрастного вещества, в настоящее время проходящего клиническую оценку. [20]

Технология ESAC использовалась для выделения мощных ингибиторов бычьего трипсина и для идентификации новых ингибиторов стромелизина-1 ( ММП-3 ), матриксной металлопротеиназы, участвующей как в физиологических, так и в патологических процессах ремоделирования тканей, а также в патологических процессах, таких как артрит и метастазы . [21]

Технологии, основанные на эволюции

ДНК-маршрутизация

В 2004 году DR Halpin и PB Harbury представили новый интригующий метод построения ДНК-кодируемых библиотек. Впервые ДНК-конъюгированные шаблоны служили как для кодирования, так и для программирования инфраструктуры «разделенного и объединенного» синтеза компонентов библиотеки. [22] Дизайн Halpin и Harbury позволил чередовать раунды отбора, ПЦР-амплификацию и диверсификацию с помощью небольших органических молекул, в полной аналогии с технологией фагового дисплея . Механизм маршрутизации ДНК состоит из ряда соединенных колонок, несущих связанные со смолой антикодоны, которые могли бы последовательно-специфически разделять популяцию ДНК-шаблонов в пространственно различные местоположения путем гибридизации . [22] Согласно этому протоколу разделения и объединения была создана пептидная комбинаторная библиотека, кодируемая ДНК из 10 6 членов. [23]

ДНК-шаблонный синтез

Рис. 2 Библиотека, кодируемая ДНК с помощью «ДНК-шаблонного синтеза» Библиотека олигонуклеотидов (т. е. 64 различных олигонуклеотида), содержащая три кодирующих региона, была гибридизирована с библиотекой конъюгатов реагент-соединение-олигонуклеотид (т. е. 4 конъюгата реагент-олигонуклеотид), способных образовывать пары с исходным кодирующим доменом шаблонного олигонуклеотида. После переноса соединений на соответствующий шаблон олигонуклеотида цикл синтеза повторялся необходимое количество раз с дополнительными наборами конъюгатов соединение-носитель-олигонуклеотид (т. е. два раунда с четырьмя конъюгатами соединение-носитель-олигонуклеотид на раунд). Затем был выполнен функциональный отбор, и последовательность связывающей матрицы была амплифицирована с помощью ПЦР. Таким образом, секвенирование ДНК позволило идентифицировать связывающую молекулу.

В 2001 году Дэвид Лю и его коллеги показали, что комплементарные ДНК- олигонуклеотиды могут использоваться для содействия определенным синтетическим реакциям , которые неэффективно протекают в растворе при низкой концентрации . [24] [25] ДНК-гетеродуплекс использовался для ускорения реакции между химическими группами, отображаемыми на концах двух цепей ДНК. Кроме того, было показано, что «эффект близости», который ускоряет бимолекулярную реакцию, не зависит от расстояния (по крайней мере, в пределах расстояния 30 нуклеотидов ). [24] [25] В последовательно-программируемой манере олигонуклеотиды, несущие одну химическую реагирующую группу, были гибридизированы с комплементарными производными олигонуклеотидов, несущими другую реактивную химическую группу. Близость, обеспечиваемая гибридизацией ДНК, радикально увеличивает эффективную молярность реагентов реакции, присоединенных к олигонуклеотидам, что позволяет желаемой реакции происходить даже в водной среде при концентрациях, которые на несколько порядков ниже тех, которые необходимы для соответствующей обычной органической реакции, не основанной на ДНК-шаблоне. [26] Используя шаблонную установку ДНК и синтез с программированием последовательности, Лю и его коллеги создали библиотеку макроциклов, состоящую из 64 членов, кодируемых ДНК . [27]

Технология трехмерной близости (технология YoctoReactor)

YoctoReactor (yR) — это 3D-подход, основанный на близости, который использует самоорганизующуюся природу ДНК-олигонуклеотидов в 3-, 4- или 5-сторонние соединения для направления синтеза малых молекул в центр соединения. Рисунок 5 иллюстрирует базовую концепцию с 4-сторонним соединением ДНК.

Рис. 5. Основной принцип YoctoReactor. Центр 3-, 4- и 5-канальных соединений ДНК (здесь показано 4-канальное соединение) становится реактором масштаба йоктолитра , где синтез малых молекул облегчается в том, что было названо YoctoReactor (yR). Цветные круги изображают химические строительные блоки (BB), которые прикреплены к тщательно разработанным олигонуклеотидам ДНК (черные линии). После отжига ДНК BB приближаются к центру соединения ДНК, где они подвергаются химической реакции.

Центр соединения ДНК составляет объем порядка йоктолитра , отсюда и название YoctoReactor. Этот объем содержит реакцию одной молекулы, дающую реакционные концентрации в диапазоне высоких мМ. Эффективная концентрация, обеспечиваемая ДНК, значительно ускоряет химические реакции, которые в противном случае не происходили бы при фактической концентрации на несколько порядков ниже.

Создание библиотеки yR

На рисунке 6 показано создание библиотеки yR с использованием трехстороннего соединения ДНК.

Рис. 6 Сборка библиотеки YoctoReactor. Поэтапная сборка библиотеки DEL с использованием технологии YoctoReactor. Здесь показан 3-ходовой реактор. (a) Позиция 1 (P1) и P2 BB сближаются и подвергаются химической реакции в присутствии вспомогательного олигонуклеотида в P3. (b) Структура очищается с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE), ДНК P1 и P2 лигируется, а линкер P2 расщепляется. (c) P3 BB отжигается с продуктом лигирования P1-P2 со стадии b, и происходит химическая реакция между P2 и P3 BB. (d) Продукт реакции очищается с помощью PAGE, ДНК лигируется, а линкер P3 расщепляется, давая соединение (OOO), ковалентно присоединенное к свернутому yR. (e) yR разбирается путем удлинения праймера, в результате чего образуется двухцепочечный дисплейный продукт, который подвергается отбору и молекулярной эволюции.

Подводя итог, химические строительные блоки (BB) присоединяются через расщепляемые или нерасщепляемые линкеры к трем типам биспецифических ДНК-олигонуклеотидов (олиго-BB), представляющих каждое плечо yR. Для облегчения синтеза комбинаторным способом олиго-BB разрабатываются таким образом, что ДНК содержит (a) код для прикрепленного BB на дистальном конце олиго (цветные линии) и (b) области постоянной последовательности ДНК (черные линии), чтобы вызвать самосборку ДНК в трехстороннее соединение (независимо от BB) и последующую химическую реакцию. Химические реакции выполняются с помощью пошаговой процедуры, и после каждого шага ДНК лигируется, а продукт очищается электрофорезом в полиакриламидном геле. Расщепляемые линкеры (BB-DNA) используются для всех позиций, кроме одной, что дает библиотеку малых молекул с одной ковалентной связью с кодом ДНК. В таблице 1 показано, как можно создавать библиотеки разных размеров с использованием технологии yR.

Таблица 1. Размер библиотеки YoctoReactor. Размер библиотеки yR является функцией количества различных функционализированных олигонуклеотидов, используемых в каждой позиции, и количества позиций в соединении ДНК.

Подход к дизайну yR обеспечивает неизменный реакционный участок с учетом как (a) расстояния между реагентами, так и (b) среды последовательности, окружающей реакционный участок. Более того, тесная связь между кодом и BB на фрагментах олиго-BB, которые смешиваются комбинаторно в одном сосуде, придает высокую точность кодированию библиотеки. Код синтезированных продуктов, кроме того, не задан заранее, а скорее собирается комбинаторно и синтезируется синхронно с врожденным продуктом.

Однородный скрининг библиотек yoctoreactor

Недавно был разработан гомогенный метод скрининга библиотек yoctoreactor (yR), который использует технологию эмульсии вода-в-масле для изоляции отдельных комплексов лиганд-цель. Называемый Binder Trap Enrichment (BTE), лиганды к целевому белку идентифицируются путем захвата пар связывания (меченый ДНК белок-цель и лиганд yR) в капельках эмульсии во время кинетики с преобладанием диссоциации. После захвата ДНК целевого объекта и лиганда соединяются путем лигирования, тем самым сохраняя информацию о связывании.

В дальнейшем идентификация попаданий по сути является упражнением по подсчету: информация о событиях связывания расшифровывается путем секвенирования и подсчета присоединенной ДНК - селективные связыватели подсчитываются с гораздо большей частотой, чем случайные связыватели. Это возможно, поскольку случайное улавливание мишени и лиганда "разбавляется" большим количеством капель воды в эмульсии. Низкий уровень шума и фонового сигнала, характерный для BTE, объясняется "разбавлением" случайного сигнала, отсутствием поверхностных артефактов и высокой точностью библиотеки yR и метода скрининга. Скрининг выполняется методом одной пробирки. Биологически активные попадания идентифицируются в одном раунде BTE, характеризующемся низким уровнем ложноположительных результатов.

BTE имитирует неравновесную природу взаимодействий лиганда и мишени in vivo и предлагает уникальную возможность скрининга целевых лигандов на основе времени удержания лиганда и мишени, поскольку эмульсия, которая захватывает связывающий комплекс, образуется во время фазы динамической диссоциации.

Расшифровка химических библиотек, закодированных в ДНК

После выбора из ДНК-кодированных химических библиотек стратегия декодирования для быстрой и эффективной идентификации специфических связывающих соединений имеет решающее значение для дальнейшего развития технологии DEL . До сих пор основными методологиями для декодирования ДНК-кодированных библиотек были декодирование на основе секвенирования Сэнгера , методология на основе микрочипов и методы высокопроизводительного секвенирования .

Декодирование на основе секвенирования Сэнгера

Хотя многие авторы неявно предполагали традиционное декодирование на основе секвенирования по Сэнгеру , [7] [8] [18] [23] [27] количество кодов для секвенирования просто в соответствии со сложностью библиотеки, безусловно, является нереалистичной задачей для традиционного подхода к секвенированию по Сэнгеру . Тем не менее, реализация секвенирования по Сэнгеру для декодирования химических библиотек, кодируемых ДНК, в высокопроизводительном режиме была описана первой. [18] После отбора и ПЦР-амплификации ДНК-меток соединений библиотеки были получены конкатамеры, содержащие несколько кодирующих последовательностей, и лигированы в вектор . Последующее секвенирование по Сэнгеру репрезентативного числа полученных колоний выявило частоты кодов, присутствующих в образце библиотеки, кодируемой ДНК, до и после отбора. [18]

Декодирование на основе микрочипов

ДНК- микрочип — это устройство для высокопроизводительных исследований, широко используемое в молекулярной биологии и медицине . Он состоит из выстроенной серии микроскопических пятен («признаков» или «местоположений»), содержащих несколько пикомолей олигонуклеотидов, несущих определенную последовательность ДНК. Это может быть короткий участок гена или другого элемента ДНК, которые используются в качестве зондов для гибридизации образца ДНК или РНК в подходящих условиях. Гибридизация зонд-мишень обычно обнаруживается и количественно определяется с помощью флуоресцентного обнаружения меченых флуорофором мишеней для определения относительного содержания целевых последовательностей нуклеиновых кислот . Микрочип использовался для успешного расшифровки библиотек, кодируемых ДНК ESAC [18] и библиотек, кодируемых ПНК [28] . Кодирующие олигонуклеотиды , представляющие отдельные химические соединения в библиотеке, наносятся и химически связываются на предметные стекла микрочипа с помощью робота BioChip Arrayer. Затем олигонуклеотидные метки связывающих соединений, выделенных из отбора, амплифицируются ПЦР с использованием флуоресцентного праймера и гибридизуются на слайде ДНК- микрочипа . Затем микрочипы анализируются с использованием лазерного сканирования, а интенсивности пятен определяются и количественно определяются. Обогащение предпочтительных связывающих соединений выявляется путем сравнения интенсивности пятен слайда ДНК- микрочипа до и после отбора. [18]

Декодирование с помощью высокопроизводительного секвенирования

В соответствии со сложностью химической библиотеки, кодируемой ДНК (обычно от 10 3 до 10 6 членов), традиционное декодирование на основе секвенирования по Сэнгеру вряд ли будет применимо на практике из-за высокой стоимости за основание для секвенирования и утомительной процедуры. [29] Технологии высокопроизводительного секвенирования использовали стратегии, которые распараллеливают процесс секвенирования, вытесняя использование капиллярного электрофореза и производя тысячи или миллионы последовательностей одновременно. В 2008 году была описана первая реализация метода высокопроизводительного секвенирования, первоначально разработанного для секвенирования генома (т. е. « технология 454 »), для быстрого и эффективного декодирования химической библиотеки, кодируемой ДНК, включающей 4000 соединений. [16] Это исследование привело к идентификации новых химических соединений с субмикромолярными константами диссоциации по отношению к стрептавидину и определенно показало возможность конструирования, выполнения отбора и декодирования библиотек, кодируемых ДНК, содержащих миллионы химических соединений. [16]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Смит ГП (июнь 1985). «Нитчатый слитый фаг: новые векторы экспрессии, которые отображают клонированные антигены на поверхности вириона». Science . 228 (4705): 1315– 7. Bibcode :1985Sci...228.1315S. doi :10.1126/science.4001944. PMID  4001944.
  2. ^ Hoogenboom HR (2002). "Обзор технологии отображения фагов антител и ее применения". Antibody Phage Display . Методы в молекулярной биологии. Т. 178. Humana Press. С.  1– 37. doi :10.1385/1-59259-240-6:001. ISBN 978-1-59259-240-1. PMID  11968478.
  3. ^ Фурка А. В случае необходимости, пептидный комплексный пептид может быть легко поврежден. Исследование возможности систематического поиска фармацевтически полезных пептидов) https://mersz.hu/mod/object.php?objazonosito=matud202006_f42772_i2
  4. ^ Фурка А (2002). Комбинаторная химия 20 лет спустя.., Drug DiscovToday 7; 1-4.
  5. ^ Гуднау, Роберт А. младший (2014). СПРАВОЧНИК ПО ДНК-КОДИРОВАННОЙ ХИМИИ. Теория и применение для исследования химического пространства и открытия лекарств . Уолтем, Массачусетс, США: John Wiley & Sons, Inc., Хобокен, Нью-Джерси. С.  2–13 .
  6. ^ Brenner S, Lerner RA (июнь 1992). «Закодированная комбинаторная химия». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 89 (12): 5381– 3. Bibcode :1992PNAS...89.5381B. doi : 10.1073/pnas.89.12.5381 . PMC 49295 . PMID  1608946. 
  7. ^ abc Nielsen J, Brenner S, Janda KD (1993). «Синтетические методы для реализации кодированной комбинаторной химии». Журнал Американского химического общества . 115 (21): 9812– 9813. doi :10.1021/ja00074a063.
  8. ^ ab Needels MC, Jones DG, Tate EH, Heinkel GL, Kochersperger LM, Dower WJ, Barrett RW, Gallop MA (ноябрь 1993 г.). «Создание и скрининг библиотеки синтетических пептидов, кодируемых олигонуклеотидами». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 90 (22): 10700– 4. Bibcode : 1993PNAS...9010700N. doi : 10.1073/pnas.90.22.10700 . PMC 47845. PMID  7504279 . 
  9. ^ Мукунд С. Чоргаде (2006). Открытие и разработка лекарств . Нью-Йорк: Wiley-Interscience. С.  129–167 . ISBN 978-0-471-39848-6.
  10. ^ Heitner TR, Hansen NJ (ноябрь 2009 г.). «Оптимизация обнаружения и оптимизации хитов с помощью ДНК-реактора масштаба йоктолитра». Мнение эксперта по обнаружению лекарств . 4 (11): 1201– 13. doi :10.1517/17460440903206940. PMID  23480437. S2CID  20881306.
  11. ^ ab Á. Furka, F. Sebestyén, M. Asgedom, G. Dibó, Cornucopia of пептиды путем синтеза в Highlights of Modern Biochemistry, Proceedings of the 14th International Congress of Biochemistry, VSP. Утрехт, Нидерланды, 1988, т. 5, стр. 47.
  12. ^ ab Furka Á, Sebestyén F, Asgedom M, Dibó G (1991) Общий метод быстрого синтеза многокомпонентных пептидных смесей. Int J Peptide Protein Res 37; 487-93.
  13. ^ Харбери Д.Р., Халпин Д.Р. (2000) WO 00/23458.
  14. ^ Winssinger N, Damoiseaux R, Tully DC, Geierstanger BH, Burdick K, Harris JL (октябрь 2004 г.). «Микроматрицы субстратов протеазы, кодируемых PNA». Химия и биология . 11 (10): 1351– 60. doi : 10.1016/j.chembiol.2004.07.015 . PMID  15489162.
  15. ^ Zambaldo C, Barluenga S, Winssinger N (июнь 2015 г.). «Химические библиотеки, кодируемые PNA». Current Opinion in Chemical Biology . 26 : 8–15 . doi :10.1016/j.cbpa.2015.01.005. PMID  25621730.
  16. ^ abcd Mannocci L, Zhang Y, Scheuermann J, Leimbacher M, De Bellis G, Rizzi E, Dumelin C, Melkko S, Neri D (ноябрь 2008 г.). «Высокопроизводительное секвенирование позволяет идентифицировать связывающие молекулы, выделенные из химических библиотек, кодируемых ДНК». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 105 (46): 17670– 5. Bibcode : 2008PNAS..10517670M . doi : 10.1073/pnas.0805130105 . PMC 2584757. PMID  19001273. 
  17. ^ Buller F, Mannocci L, Zhang Y, Dumelin CE, Scheuermann J, Neri D (ноябрь 2008 г.). «Разработка и синтез новой ДНК-кодируемой химической библиотеки с использованием циклоприсоединений Дильса-Альдера». Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters . 18 (22): 5926– 31. doi :10.1016/j.bmcl.2008.07.038. PMID  18674904.
  18. ^ abcdefghi Melkko S, Scheuermann J, Dumelin CE, Neri D (май 2004 г.). «Закодированные самособирающиеся химические библиотеки». Природная биотехнология . 22 (5): 568–74 . doi : 10.1038/nbt961. PMID  15097996. S2CID  24806778.
  19. ^ Lovrinovic M, Niemeyer CM (май 2005). «ДНК-микрочипы как инструменты декодирования в комбинаторной химии и химической биологии». Angewandte Chemie . 44 (21): 3179– 83. doi :10.1002/anie.200500645. PMID  15861437.
  20. ^ Дюмелен CE, Трюссель С, Буллер Ф, Траксел Э, Бутц Ф, Чжан Ю, Манноччи Л, Бек С.С., Друмеа-Миранча М, Зилигер М.В., Балтес К., Мюглер Т., Кранц Ф., Рудин М., Мелькко С., Шойерманн Дж. , Нери Д (2008). «Портативное связующее вещество альбумина из химической библиотеки, закодированной ДНК». Ангеванде Хеми . 47 (17): 3196–201 . doi :10.1002/anie.200704936. ПМИД  18366035.
  21. ^ Melkko S, Zhang Y, Dumelin CE, Scheuermann J, Neri D (2007). «Выделение высокоаффинных ингибиторов трипсина из химической библиотеки, кодируемой ДНК». Angewandte Chemie . 46 (25): 4671– 4. doi :10.1002/anie.200700654. PMID  17497616.
  22. ^ ab Halpin DR, Harbury PB (июль 2004 г.). "Дисплей ДНК I. Маршрутизация популяций ДНК, кодируемая последовательностью". PLOS Biology . 2 (7): E173. doi : 10.1371/journal.pbio.0020173 . PMC 434148. PMID  15221027 .  Значок открытого доступа
  23. ^ ab Halpin DR, Harbury PB (июль 2004 г.). "Дисплей ДНК II. Генетическая манипуляция библиотеками комбинаторной химии для эволюции малых молекул". PLOS Biology . 2 (7): E174. doi : 10.1371/journal.pbio.0020174 . PMC 434149. PMID  15221028 .  Значок открытого доступа
  24. ^ ab Gartner ZJ, Liu DR (июль 2001 г.). «Общность синтеза на основе ДНК-шаблонов как основа для развития неприродных малых молекул». Журнал Американского химического общества . 123 (28): 6961– 3. doi :10.1021/ja015873n. PMC 2820563. PMID  11448217 . 
  25. ^ ab Calderone CT, Puckett JW, Gartner ZJ, Liu DR (ноябрь 2002 г.). «Направление иначе несовместимых реакций в одном растворе с использованием органического синтеза на основе ДНК». Angewandte Chemie . 41 (21): 4104– 8. doi :10.1002/1521-3773(20021104)41:21<4104::AID-ANIE4104>3.0.CO;2-O. PMID  12412096.
  26. ^ Li X, Liu DR (сентябрь 2004 г.). «Органический синтез на основе ДНК-шаблона: стратегия природы для контроля химической реактивности, применяемая к синтетическим молекулам». Angewandte Chemie . 43 (37): 4848– 70. doi :10.1002/anie.200400656. PMID  15372570.
  27. ^ ab Gartner ZJ, Tse BN, Grubina R, Doyon JB, Snyder TM, Liu DR (сентябрь 2004 г.). «ДНК-шаблонный органический синтез и выбор библиотеки макроциклов». Science . 305 (5690): 1601– 5. Bibcode :2004Sci...305.1601G. doi :10.1126/science.1102629. PMC 2814051 . PMID  15319493. 
  28. ^ Harris J, Mason DE, Li J, Burdick KW, Backes BJ, Chen T, Shipway A, Van Heeke G, Gough L, Ghaemmaghami A, Shakib F, Debaene F, Winssinger N (октябрь 2004 г.). «Профиль активности экстракта аллергена пылевого клеща с использованием библиотек субстратов и функциональных протеомных микрочипов». Химия и биология . 11 (10): 1361–72 . doi : 10.1016/j.chembiol.2004.08.008 . PMID  15489163.
  29. ^ Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (декабрь 1977 г.). «Секвенирование ДНК с ингибиторами обрыва цепи». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 74 (12): 5463– 7. Bibcode : 1977PNAS...74.5463S. doi : 10.1073/pnas.74.12.5463 . PMC 431765. PMID  271968 . 
Получено с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=ДНК-кодированная_химическая_библиотека&oldid=1256792662"