Космид

В этой статье есть несколько проблем. Помогите улучшить ее или обсудите эти проблемы на странице обсуждения . ( Узнайте, как и когда удалять эти сообщения ) В статье содержится список общих ссылок , но в ней отсутствуют соответствующие встроенные цитаты .Пожалуйста, помогите улучшить эту статью, добавив более точные цитаты. ( Апрель 2014 )( Узнайте, как и когда удалить это сообщение ) Для проверки данной статьи необходимы дополнительные цитаты . Please help improve this article by adding citations to reliable sources. Unsourced material may be challenged and removed. Find sources: "Cosmid" – news · newspapers · books · scholar · JSTOR (April 2014) (Learn how and when to remove this message) (Learn how and when to remove this message)

Космида — это тип гибридной плазмиды , которая содержит последовательность cos фага Lambda . ^[1] Космиды, часто используемые в качестве векторов клонирования в генной инженерии , могут использоваться для создания геномных библиотек . Впервые они были описаны Коллинзом и Хоном в 1978 году. ^[2] Космиды могут содержать от 37 до 52 (обычно 45) кб ДНК, ограничения основаны на нормальном размере упаковки бактериофага. Они могут реплицироваться как плазмиды, если у них есть подходящее начало репликации (ori): например , SV40 ori в клетках млекопитающих, ColE1 ori для двухцепочечной репликации ДНК или f1 ori для одноцепочечной репликации ДНК у прокариот . Они часто также содержат ген для селекции, такой как устойчивость к антибиотикам , так что трансформированные клетки можно идентифицировать путем высева на среду, содержащую антибиотик. Те клетки, которые не приняли космиду, не смогут расти. ^[3]

В отличие от плазмид, их также можно упаковывать in vitro в фаговые капсиды , шаг, который требует липких концов , также известных как сайты cos , также используемых при клонировании с фагом лямбда в качестве вектора, однако почти все гены лямбда были удалены, за исключением последовательности cos . Гибридная космидная ДНК в капсидах затем может быть перенесена в бактериальные клетки путем трансдукции . Поскольку существует требование к упаковке in vitro, при котором между сайтами cos требуется не менее 38 кб ДНК, вектор без вставной ДНК не будет упакован (нестабильность плазмид увеличивается, если новая вставленная ДНК содержит много прямых повторов или палиндромных (инвертированных повторов) ДНК. Эту нестабильность можно в значительной степени нейтрализовать, используя бактерию-хозяина со специфическими мутациями, влияющими на рекомбинацию ДНК (NB Отсутствие инвертированных повторов было отмечено в первой публикации Hohn & Collins, цитируемой выше; см. также ^[4] ).

Последовательности Cos имеют длину ~200 пар оснований и необходимы для упаковки. Они содержат сайт cosN , где ДНК разрезается на каждой нити, на расстоянии 12 пар оснований, терминазой. Это вызывает линеаризацию кольцевой космиды с двумя «сцепленными» или «липкими концами» по 12 пар оснований. (ДНК должна быть линейной, чтобы поместиться в головку фага.) Сайт cosB удерживает терминазу, пока она разрезает и разделяет нити. Сайт cosQ следующей космиды (поскольку репликация по катящемуся кольцу часто приводит к линейным конкатемерам ) удерживается терминазой после упаковки предыдущей космиды, чтобы предотвратить деградацию клеточными ДНКазами .

Космиды в основном представляют собой плазмиды с бактериальным oriV , маркером селекции антибиотиков и сайтом клонирования, но они несут один или, в последнее время, два сайта cos, полученных из бактериофага лямбда. В зависимости от конкретной цели эксперимента доступны космиды широкого спектра хозяев, челночные космиды или космиды «млекопитающих» (связанные с oriV SV40 и маркерами селекции млекопитающих). Емкость загрузки космид варьируется в зависимости от размера самого вектора, но обычно составляет около 40–45 кб. Процедура клонирования включает в себя создание двух векторных плеч, которые затем присоединяются к чужеродной ДНК. Отбор против ДНК космиды дикого типа осуществляется просто с помощью исключения размера. Поэтому космиды всегда образуют колонии, а не бляшки. Кроме того, плотность клонов намного ниже и составляет около 10 ⁵ – 10 ⁶ КОЕ на мкг лигированной ДНК.

После построения рекомбинантных лямбда- или космидных библиотек общая ДНК переносится в соответствующего хозяина E. coli с помощью техники, называемой упаковкой in vitro. Необходимые упаковочные экстракты получают из лизогенов E. coli cI857 (red-gam-Sam и Dam (сборка головки) и Eam (сборка хвоста) соответственно). Эти экстракты распознают и упаковывают рекомбинантные молекулы in vitro , генерируя либо зрелые фаговые частицы (векторы на основе лямбда), либо рекомбинантные плазмиды, содержащиеся в оболочках фагов (космиды). Эти различия отражаются в различных частотах заражения, наблюдаемых в пользу векторов с заменой лямбда. Это компенсирует их немного меньшую грузоподъемность. Фаговые библиотеки также легче хранить и проверять, чем космидные библиотеки.

Целевая ДНК: геномная ДНК, которую нужно клонировать, должна быть разрезана на фрагменты рестрикции соответствующего размера. Обычно это делается путем частичной рестрикции с последующим фракционированием по размеру или дефосфорилированием (с использованием фосфатазы кишечника теленка), чтобы избежать скремблирования хромосом, т. е. лигирования физически несвязанных фрагментов.

Обычно используемые векторы включают «SuperCos 1»