Cas12a

CRISPR-ассоциированный белок 12a
Acidaminococcus sp. Cas12a PDB : 5B43
Идентификаторы
Символ	Cas12a
ИнтерПро	IPR027620

Cas12a ( белок 12a , ассоциированный с C RISPR , ранее известный как Cpf1 ) — это подтип белков Cas12 и РНК-управляемая эндонуклеаза , которая является частью системы CRISPR у некоторых бактерий и архей . В системах CRISPR Cas12a служит для разрушения генетического материала вирусов и другой чужеродной ДНК, тем самым защищая клетку от инфекции. Как и другие ферменты Cas, Cas12a связывается с РНК (называемой crRNA в случае Cas12a) для нацеливания нуклеиновой кислоты в специфическом и программируемом веществе. В организме хозяина crRNA содержит константную область, которая распознается белком Cas12a, и спейсерную область, которая комплементарна части чужеродной нуклеиновой кислоты (т. е. фагу ), которая ранее заразила клетку. ^[1]

Программируемая природа Cas12a делает этот фермент полезным инструментом для биотехнологии и биологических исследований. Изменяя последовательность спейсера в crRNA, исследователи могут нацеливать Cas12a на определенные последовательности ДНК, что позволяет создавать высокоцелевые модификации ДНК , аналогичные системе CRISPR- Cas9 . ^[2] Cas12a отличается от Cas9 своим единственным активным сайтом эндонуклеазы RuvC , своим предпочтением к 5'- протоспейсеру, смежному мотиву , и созданием липких, а не тупых концов в месте разреза. Эти и другие отличия могут сделать его более подходящим для определенных приложений. Помимо использования в фундаментальных исследованиях , CRISPR-Cas12a может найти применение в лечении генетических заболеваний и в реализации генных драйвов . ^[2]

CRISPR-Cas12a был найден путем поиска в опубликованной базе данных бактериальных генетических последовательностей для перспективных фрагментов ДНК. Его идентификация с помощью биоинформатики как белка системы CRISPR, его наименование и скрытая марковская модель (HMM) для его обнаружения были предоставлены в 2012 году в выпуске базы данных семейств белков TIGRFAMs . Cas12a встречается во многих бактериальных видах. Конечная эндонуклеаза Cas12a, которая была разработана в качестве инструмента для редактирования генома, была взята из одного из первых 16 видов, которые, как известно, содержали ее. ^[3] Два кандидата-фермента из Acidaminococcus и Lachnospiraceae демонстрируют эффективную активность редактирования генома в клетках человека. ^[2]

Системы CRISPR-Cas делятся на два класса: Класс 1 использует несколько белков Cas вместе с РНК CRISPR (crRNA) для построения функциональной эндонуклеазы, в то время как системы CRISPR Класса 2 используют одну эндонуклеазу Cas с crRNA. Согласно этой классификации, Cas12a была идентифицирована как система CRISPR-Cas Класса II, Типа V. ^[4]

CRISPR ( Clustered R egularly Interspaced Short Palindromic R epeats ) назван в честь особенностей инвариантных последовательностей ДНК, участвующих в нацеливании. Cas12a изначально был известен как Cpf1 как аббревиатура от CRISPR и двух родов бактерий, у которых он появляется, Prevotella и Francisella . Он был переименован в 2015 году после более широкой рационализации названий белков Cas ( C RISPR as sociated) для соответствия их гомологии последовательностей . ^[4]

Локус Cas12a содержит смешанный альфа / бета- домен, RuvC-I, за которым следует спиральная область, RuvC-II и домен, подобный цинковому пальцу . ^[5] Белок Cas12a имеет домен эндонуклеазы, подобный RuvC , который похож на домен RuvC Cas9. Кроме того, Cas12a не имеет домена эндонуклеазы HNH, а N-конец Cas12a не имеет альфа-спиральной распознающей доли Cas9. ^[4]

Архитектура домена Cas12a CRISPR-Cas показывает, что Cas12a функционально уникален, классифицируясь как система CRISPR класса 2, типа V. Локусы Cas12a кодируют белки Cas1 , Cas2 и Cas4, более похожие на типы I и III, чем на системы типа II. Поиск в базах данных показывает обилие белков семейства Cas12a во многих видах бактерий. ^[4]

Функциональный Cas12a не нуждается в tracrRNA , поэтому требуется только crRNA. Это выгодно для редактирования генома, поскольку Cas12a не только меньше Cas9, но и имеет меньшую молекулу sgRNA (примерно вдвое меньше нуклеотидов , чем Cas9). ^[6]

Комплекс Cas12a-crRNA расщепляет целевую ДНК или РНК путем идентификации смежного мотива протоспейсера (PAM) 5'-YTN-3' ^[7] (где «Y» представляет собой пиримидин ^[8] , а «N» представляет собой любое нуклеиновое основание ), в отличие от богатого G PAM, на который нацелен Cas9. После идентификации PAM Cas12a вводит двухцепочечный разрыв ДНК в виде липкого конца из 4 или 5 выступающих нуклеотидов. ^[5]

Система CRISPR-Cas12a состоит из фермента Cas12a и направляющей РНК, которая находит и размещает комплекс в правильном месте двойной спирали для расщепления целевой ДНК. Активность системы CRISPR-Cas12a имеет три стадии: ^[3]

• Адаптация: белки Cas1 и Cas2 облегчают адаптацию небольших фрагментов ДНК в массиве CRISPR.
• Формирование crРНК: процессинг пре-crРНК с образованием зрелых crРНК для управления белком Cas.
• Интерференция: Cas12a связан с crRNA, образуя бинарный комплекс для идентификации и расщепления целевой последовательности ДНК. Комплекс crRNA-Cas12a ищет в dsDNA 3-6nt 5' protospacer neighbor motif (PAM). Как только PAM найден, белок локально денатурирует dsDNA и ищет комплементарность между crRNA spacer и ssDNA protospacer. Достаточная комплементарность вызовет активность RuvC, и активный сайт RuvC затем разрежет нецелевую цепь, а затем целевую цепь, в конечном итоге генерируя ступенчатый разрыв dsDNA с 5' ssDNA выступами (цис-расщепление). ^{[5] [9]}

Cas9 требует две молекулы РНК для разрезания ДНК, в то время как Cas12a нужна одна. Белки также разрезают ДНК в разных местах, предоставляя исследователям больше возможностей при выборе места редактирования. Cas9 разрезает обе нити в молекуле ДНК в одном и том же положении, оставляя тупые концы . Cas12a оставляет одну нить длиннее другой, создавая липкие концы . Липкие концы имеют другие свойства, чем тупые концы во время негомологичного соединения концов или гомологичной репарации ДНК, что дает Cas12a определенные преимущества при попытке вставки генов по сравнению с Cas9. ^[3] Хотя система CRISPR-Cas9 может эффективно отключать гены, вставлять гены или генерировать knock-in сложно. ^[1] Cas12a не имеет tracrRNA , использует T-богатый PAM и расщепляет ДНК через ступенчатый DSB ДНК. ^[6]

Подводя итог, можно сказать, что важные различия между системами Cas12a и Cas9 заключаются в том, что Cas12a: ^[10]

• Распознает различные PAM, открывая новые возможности таргетинга.
• Создает липкие концы длиной 4–5 нуклеотидов вместо тупых концов, образуемых Cas9, что повышает эффективность генетических вставок и специфичность во время NHEJ или HDR.
• Разрезает целевую ДНК дальше от PAM и от участка разрезания Cas9, открывая новые возможности для расщепления ДНК.

Эндонуклеазы Cas12 в конечном итоге, вероятно, произошли от эндонуклеазы TnpB транспозонов семейства IS200/IS605. TnpB , еще не «одомашненные» в иммунной системе CRISPR, сами способны выполнять расщепление, направляемое РНК, используя систему шаблонов OmegaRNA . ^[11]

Множество аспектов влияют на эффективность и специфичность цели при использовании CRISPR, включая дизайн направляющей РНК. Было разработано много моделей дизайна и программных инструментов CRISPR-Cas для оптимального дизайна направляющей РНК. К ним относятся SgRNA designer, CRISPR MultiTargeter, SSFinder. ^[12] Кроме того, доступны коммерческие антитела для использования для обнаружения белка Cas12a. ^[13]

CRISPR-Cas9 является предметом споров об интеллектуальной собственности , в то время как CRISPR-Cas12a не имеет таких проблем. ^[2]