CRISPR-дисплей

В этой статье есть несколько проблем. Помогите улучшить ее или обсудите эти проблемы на странице обсуждения . ( Узнайте, как и когда удалять эти сообщения ) Для проверки данной статьи необходимы дополнительные цитаты .Пожалуйста, помогите улучшить эту статью , добавив ссылки на надежные источники . Неподтвержденный материал может быть оспорен и удален. Найти источники:  "CRISPR-Display" – новости  · газеты  · книги  · ученый  · JSTOR ( март 2017 г. )( Узнайте, как и когда удалить это сообщение ) Эта статья может оказаться слишком сложной для понимания большинством читателей .Пожалуйста, помогите улучшить его, чтобы сделать его понятным для неспециалистов , не удаляя технические детали. ( март 2017 г. )( Узнайте, как и когда удалить это сообщение ) ( Узнайте, как и когда удалить это сообщение )

CRISPR-Display ( CRISP-Disp ) — это модификация системы CRISPR/Cas9 (Clustered regular interspaced short palindromic repeats) для редактирования генома. Система CRISPR/Cas9 использует последовательность короткой направляющей РНК (sgRNA) для направления нуклеазы Cas9 Streptococcus pyogenes , действующей как программируемый ДНК-связывающий белок, для расщепления ДНК в интересующем сайте. ^{[1] [2]}

CRISPR-Display, напротив, использует дефицитный по нуклеазе Cas9 (dCas9) и сконструированную sgRNA с аптамерными вспомогательными доменами РНК, варьирующимися от 100 п.н. до 5 кб, за пределами нормальной комплементарной целевой последовательности. ^[3] Вспомогательные домены РНК могут быть функциональными доменами, такими как длинные некодирующие РНК ( lncRNAs ), белок-связывающие мотивы или эпитопные метки для иммунохимии. Это позволяет исследовать функциональность определенных lncRNAs и нацеливать комплексы рибонуклеопротеинов (RNP) на геномные локусы.

Технология CRISPR-Display была впервые опубликована в журнале Nature Methods в июле 2015 года. Она была разработана Дэвидом М. Шехнером, Эзги Хаджисулейман, Скоттом Т. Янгером и Джоном Ринном в Гарвардском университете и Массачусетском технологическом институте (MIT), США.

Система CRISPR/Cas9 основана на адаптивной иммунной системе прокариотических организмов, и ее использование для редактирования генома было впервые предложено и разработано в сотрудничестве между Дженнифер Дудна ( Калифорнийский университет в Беркли ) и Эммануэль Шарпантье ( Институт биологии инфекций Общества Макса Планка , Германия). ^[1] Метод и его применение для редактирования человеческих клеток были опубликованы в журнале Science 17 августа 2012 года. В январе 2013 года лаборатория Фэн Чжана в Институте Брода при Массачусетском технологическом институте опубликовала в журнале Science еще один метод, дополнительно оптимизировав структуру и экспрессию sgRNA для использования в клетках млекопитающих. ^[2] К началу 2014 года было опубликовано почти 2500 исследований, упоминающих CRISPR в своем названии.

Некодирующие РНК (нкРНК) — это транскрипты РНК, которые не транслируются в белковый продукт, а вместо этого выполняют свою функцию как молекулы РНК. Они участвуют в ряде процессов, таких как посттранскрипционная регуляция экспрессии генов, геномный импринтинг и регулирование состояния хроматина и, следовательно, экспрессии данного локуса. Было обнаружено много нкРНК, но во многих случаях их функция еще не была точно изучена из-за технических проблем. Функция нкРНК часто не затрагивается введением точечных мутаций и преждевременных стоп-кодонов. Также считается, что нкРНК регулируют экспрессию генов, поэтому исследования делеций с трудом различают эффекты потери нкРНК от эффектов неправильной регуляции генов из-за делеции. Исследования нкРНК также не обладают необходимой пропускной способностью для различения функциональности на основе РНК. Для решения этих задач лаборатория Ринна разработала подход синтетической биологии, используя систему CRISPR/Cas9, где Cas9 выступает в качестве проводника, для нацеливания модулей некодируемых РНК на эктопические участки генома и изучения влияния некодируемых РНК на репортерные гены и другие геномные особенности в этом месте.

CRISPR-Disp модифицирует технологию CRISPR/Cas9, используя каталитически неактивный, т.е. дефицитный по нуклеазе, мутант Cas9 (dCas9) и изменяя РНК, используемую для нацеливания Cas9 на геномную область.

Поскольку sgRNA обычно экспрессируются РНК-полимеразой III , которая ограничивает длину домена РНК, который может быть вставлен, CRISPR-Display включает РНК-полимеразу II , чтобы разрешить экспрессию более длинных транскриптов (~80–250 нуклеотидов) для преодоления этого ограничения. Поэтому CRISPR-Display может добавлять более крупные домены РНК, такие как естественные и lncRNA домены, не влияя на локализацию dCas9.

sgRNA сконструирована с аптамерным вспомогательным доменом РНК в последовательности за пределами целевой последовательности. При разработке методики использовались пять модельных кофакторов с различными топологическими конструкциями: TOP1-4 и INT с вспомогательным доменом (домен P4-P6) в разных положениях, включая 5' и 3' концы и внутри sgRNA. Каждый домен содержал петлю-стебель, которая может быть распознана белком оболочки бактериофага PP7. Комплекс был доставлен в клетки млекопитающих (клетки HEK293FT) с помощью лентивирусного вектора .

Чтобы гарантировать, что присоединенный модуль РНК сохраняет как целевую функциональность, так и полученный сложный привод транскрипционной активации в определенном интересующем сайте, была измерена временная экспрессия репортерного гена люциферазы и флуоресцентного белка. Было проведено два варианта такого анализа активатора транскрипции : напрямую с dCas9, слитым с транскрипционным активатором/репрессором (VP64, фактор, который, как известно, усиливает экспрессию генов) (прямая активация), или косвенно, когда транскрипционный активатор слит с модулем связывающего РНК белка на sgRNA (мостовая активация) . Активация репортерного гена посредством прямой активации подразумевает, что вариант sgRNA эффективно связывает и нацеливает dCas9. Все пять топологий показали прямую активацию, за исключением TOP3 и TOP4, которые показали сниженную активность. Мостовая активация указывает на то, что слитый вспомогательный домен РНК остается нетронутым в зрелых комплексах dCas9. Мостовая активация наблюдалась с TOP1, TOP3 и INT. Результаты были повторены в эндогенных локусах путем нацеливания минимальной sgRNA и селективных расширенных топологий (TOP1 и INT) на человеческие промоторы ASCL1, IL1RN, NTF3 и TTN. Прямая и мостиковая активация наблюдалась с помощью qRT-PCR для каждой конструкции, доказывая, что CRISP-Disp позволяет развертывать большие домены РНК в геномных локусах.

Влияние размера внутренней (стебель-петля) вставки на комплекс dCas9 оценивалось с использованием конструкций типа INT с кассетами стебель-петли PP7 с диапазоном размеров от 25 нт до 247 нт. Каждая конструкция вызывала значительную активацию в репортерных анализах, что означает, что размер внутренней вставки не влияет на функцию комплекса dCas9. Аналогичным образом, влияние последовательности внутренней вставки также определялось с помощью набора уникальных вариантов sgRNA, отображающих кассеты из 25 случайных нуклеотидов. Репортерные анализы и RIP-Seq подтвердили, что последовательность не управляет эффективностью комплекса.

Полезность CRISP-Disp была исследована с массивом функциональных доменов РНК, таких как естественные мотивы связывания белков, искусственные аптамеры и малые молекулы с различным размером. Хотя все комплексы были функциональными и жизнеспособными и успешно развертывали домены РНК в эндогенных локусах, эффективность менялась с длиной и уровнями экспрессии. Это говорит о том, что оптимизация структуры и последовательности может быть важной, необходимой перед проектированием конструкции.

Чтобы определить, можно ли использовать искусственные каркасы lncRNA с CRISPR-Display, комплексы dCas9 были собраны с искусственной РНК с размером, сопоставимым с lncRNA. Конструкции были расширены до размера ~650 нт с дополнительным доменом P4-P6 со шпильковыми петлями, которые могут быть распознаны другим белком оболочки фага, MS2. Эти топологические конструкции были названы двойными TOP0-2 с двумя доменами либо вместе на 5' или 3' конце, либо отдельно на каждом конце. Анализы с транзиентным репортером, за которыми последовало подтверждение с помощью секвенирования иммунопреципитации РНК (RIP-qPCR), показали, что все три конструкции сохранили оба домена в комплексе.

Это также было протестировано с естественными доменами lncRNA путем создания конструкций TOP1 и INT, управляемых Pol II, слитых с доменами lncRNA человека. Использованные lncRNA имели длину от ~90 до 4800 нуклеотидов и включали NoRC-связывающую pRNA, три энхансер-транскрибируемые РНК (eRNA) FALEC, TRERNA1 и ncRNA-a3), Xist A-повтор (RepA) и транскрипционный активатор HOTTIP длиной 4799 нуклеотидов . Хотя все конструкции показали значительную прямую активацию, она уменьшалась с увеличением длины lncRNA-sgRNA. Эти домены lncRNA могли регулировать репортеры независимо от dCas9 с pRNA и RepA, подавляющими экспрессию репортера GLuc (репрессоры), и TRERNA1, ncRNA-a3 и HOTTIP, вызывающими активацию (активаторы), но были правильно нацелены на эктопическое местоположение интереса с помощью системы CRISP-Disp. ^[3]

Таким образом, CRISP-Disp позволяет контролировать экспрессию генов с использованием как искусственных каркасов, так и естественных доменов lncRNA.

CRISPR-Display позволяет проводить ранее недоступные исследования функциональности lncRNA, функционализацию искусственной ncRNA, привлечение эндогенных и сконструированных белков к геномным локусам, а также маркировку аффинности локусов для визуализации клеток.

CRISPR-Display позволяет целенаправленно локализовать природные lncRNA в эктопических участках для исследования их функции. Воздействие природных lncRNA на различные эктопические локусы ДНК может помочь продемонстрировать влияние lncRNA на экспрессию генов и состояние хроматина, а также помочь проанализировать механизм таких эффектов. Один из основных нерешенных вопросов в изучении lncRNA заключается в том, обусловлено ли влияние на состояние хроматина или экспрессию генов, смежных с локусом lncRNA, функциональными, специфичными для последовательности механизмами самой lncRNA или просто актом транскрипции lncRNA. [ ^{4] [5]} Локализация lncRNA в эктопических участках с помощью CRISPR-Display может помочь отделить функцию самой РНК от эффектов транскрипции таких видов РНК. До CRISPR-Display такие исследования были сложными из-за низкой пропускной способности и невозможности отличить функцию lncRNA от других мешающих факторов, таких как криптически закодированные пептиды или функциональные элементы ДНК.

CRISPR-Display также позволяет целенаправленно использовать широкий спектр искусственных РНК со специфическими функциями, например, РНК для набора эндогенных РНК-связывающих белков, аффинного мечения антител и набора меченых слитых белков.

Одним из примеров функциональности искусственной ncRNA является включение доменов РНК, распознаваемых специфическими антителами к sgRNA. CRISPR-Display может нацеливать sgRNA с определенной последовательностью эпитопа на различные локусы, а антитела с флуоресцентной меткой можно использовать для визуализации локуса, показывая его локализацию в ядре и возможные взаимодействия с другими мечеными белками или геномными локусами.

Эндогенные белки, известные тем, что связывают определенный мотив РНК, могут быть привлечены в эктопические геномные локации путем включения мотива РНК в sgRNA. CRISPR-Display также может привлекать белки слияния, разработанные для связывания определенных последовательностей РНК. Привлечение этих белков может позволить изучать эффекты определенных белков и белковых комплексов на регуляцию генов и состояния хроматина, а также специфическую регуляцию определенных генов для исследования функции генов.

Благодаря модульности sgRNA, в каждой клетке могут одновременно экспрессироваться несколько различных sgRNA с различными функциональными модулями. Различные модули РНК могут работать одновременно и независимо, что позволяет, например, регулировать одно геномное местоположение, одновременно визуализируя эффекты регулирования в другом месте.

Возможные применения CRISPR-Display будут продолжать расти с дальнейшим развитием и пониманием функционализации ncRNA. Не неразумно полагать, что CRISPR-Display может однажды сделать возможными сложные системы синтетической биологии с отчетливой временной экспрессией sgRNA, а также сетями и контурами регуляции генов путем нацеливания регуляторных белков.

• Может легко вмещать большой груз РНК (до ~4,8kb, возможно, даже больше) в ядре sgRNA. Поэтому структурированные домены РНК, естественные длинные lncRNA, искусственные модули РНК и пулы случайных последовательностей могут использоваться с dCas9.
• Комплексообразование sgRNA-dCas9 не ограничивается последовательностью состава РНК-груза, но, по-видимому, не зависит от используемых РНК-модулей.
• CRISPR-Display — это модульный метод, который позволяет одновременно выполнять различные функции в различных локусах в одной и той же клетке. Использование единой конструкции с ортогональными РНК-связывающими белками, где каждый белок слит с уникальным функциональным доменом и нацелен на sgRNA, содержащую его связанный РНК-мотив. (мультиплексирование) (уже включено в приложения)
• Модули РНК могут быть добавлены в разных местах последовательности sgRNA (внутри или на 5'- или 3'-концах), что позволяет оптимизировать расположение модуля РНК или обеспечить его наилучшее функционирование.
• Позволяет конструировать комплексы Cas9 с кассетами связывания белков, искусственными аптамерами, пулами случайных последовательностей, а также естественными днРНК.

• CRISPR-Display в настоящее время ограничен количеством доступных функциональных мотивов РНК и функций связывающих РНК белков. По мере обнаружения и разработки большего количества таких мотивов и белков, дальнейшие применения CRISPR-Display могут стать возможными.
• Комплексообразование dCas9 уменьшается с увеличением длины sgRNA-lncRNA. Однако количественные выходы интактных доменов lncRNA восстанавливаются относительно соответствующей sgRNA. Поэтому целостность конструкции может зависеть от таких факторов, как длина и структура РНК.
• Разработка высокоэффективной конструкции CRISPR-Display может потребовать некоторой структурной или последовательностной оптимизации, что может привести к переменной эффективности конструкции.