Удар и дырка
Инструмент в химической генетике
Схема метода «выпуклость и отверстие». [1]

Метод bump-and-hole — это инструмент в химической генетике для изучения определенной изоформы в семействе белков без нарушения других членов семейства. Недостижимость селективного ингибирования изоформ из-за структурной гомологии в семействах белков является серьезной проблемой химической генетики. При подходе bump-and-hole интерфейс белок-лиганд конструируется для достижения селективности посредством стерической комплементарности, сохраняя при этом биохимическую компетентность и ортогональность к паре дикого типа. Обычно аналог лиганда/ингибитора с «выпуклостью» предназначен для связывания соответствующего белка с «модифицированной дыркой». Лиганды с «выпуклостью» обычно являются более объемными производными кофактора целевого белка. Белки с «модифицированной дыркой» рекомбинантно экспрессируются с заменой аминокислоты с большего остатка на меньший, например, глицин или аланин, в месте связывания кофактора. Разработанный лиганд/ингибитор обладает специфичностью к сконструированному белку из-за стерической комплементарности, но не к нативному аналогу из-за стерической интерференции. [1]

История

Вдохновение для метода bump-and-hole было получено от мутантных штаммов E. coli , которые несли мутантную версию фенилаланиновой тРНК-синтетазы A294S и выжили после воздействия p -FluoroPhe, слегка выпуклого аналога фенилаланина, который является цитотоксичным при включении в трансляцию . Мутантный штамм A294S был способен включать Phe, но не выпуклый p -FluoroPhe из-за стерического сжатия от гидроксиметилена S294. [2] Более поздняя работа в лабораториях Питера Г. Шульца и Дэвида А. Тиррелла показала, что модифицированный отверстием мутант фенилаланиновой тРНК-синтетазы A294G был способен включать выпуклый p -FluoroPhe в трансляцию, демонстрируя, что стерические манипуляции могут успешно расширить область действия субстрата, даже для высокоспецифичной аминоацилсинтетазы. [3]

Первая зарегистрированная пара «выступ-отверстие». Мутантный циклофилин S99T/F113A с измененной дыркой имеет расширенный гидрофобный карман для принятия метильного выступа в аналоге циклоспорина А MeIle11CsA. [4]

Первая пара «выпуклость-дырка», разработанная Стюартом Шрайбером и коллегами, представляла собой небольшую молекулу циклоспорина А с Ile, заменяющим Val в положении 11, и мутант циклофилина с измененной дыркой (S99T/F113A) . [5] Циклоспорин А является химическим индуктором димеризации (CID) циклофилина. Эта первая пара «выпуклость-дырка» была разработана для повышения эффективности связывания между циклоспорином А дикого типа и циклофилином, тем самым обеспечивая более эффективную CID. Было обнаружено, что измененный циклоспорин А эффективно взаимодействует с мутантом циклофилина с измененной дыркой, но не с эндогенным циклофилином. Ортогональная пара CID использовалась для ингибирования опосредованного кальциневрином дефосфорилирования ядерного фактора активированных Т-клеток специфичным для клеток и тканей образом. [6] Совсем недавно эта первая пара «выступ-отверстие» была использована для индукции сборки транслокационной 2-диоксигеназы ten-eleven в клетках для временно контролируемого деметилирования ДНК . [7]


Приложения

По мере того, как структурная информация об интерфейсах белок-лиганд стала доступной, пары «выступ-впадина» стали использоваться для выявления субстратов конкретных белков из различных классов белков, а также для разработки ортогональных неофермент-неосубстратных терапевтических средств.

Киназы

Аналог АТФ с выпуклостью N6-циклопентил АТФ не может связывать киназу v-Src дикого типа, но может связывать ее пару «выступ-впадина», киназу I338G v-Src. [8]

Человеческие протеинкиназы используют АТФ в качестве кофактора для фосфорилирования субстратных белков. Киназы играют критически важную роль в сложных сетях клеточной сигнализации. Сохраненные сайты связывания АТФ и схожие каталитические механизмы создают проблему для селективного ингибирования конкретной киназы для определения ее функции. Лаборатория Кевана Шоката разработала пары «выпуклость-дырка» с использованием мутантов киназы с объемными остатками «привратника» в кармане связывания АТФ, замененными на Gly или Ala, и объемными аналогами АТФ. В ранних работах было показано, что мутанты v-Src-киназы I338A/G принимают меченные [γ- 32 P] N 6 -циклопентил и N 6 -бензил аналоги АТФ в качестве альтернативных кофакторов для радиоактивной маркировки своих субстратов. [8] Только мутантная киназа была способна связывать выпуклые аналоги АТФ, что позволяет маркировать субстраты, специфичные для сконструированной v-Src-киназы. Очистка и протеомика на основе МС дали субстраты киназы v-Src. Дырочно-модифицированная киназа и усиленные пары аналогов АТФ позволили провести профилирование субстратов нескольких других киназ, включая CDK1 , Pho85, ERK2 и JNK. [9]

Хотя усиленные аналоги ATM могут помочь деконволюции профилей субстрата киназы, одним из недостатков этой стратегии является клеточная непроницаемость усиленных аналогов. Чтобы обойти это, группа Shokat продемонстрировала, что усиленный аналог АТФ, кинетин АТФ или KTP, может быть синтезирован эндогенно в клетках, культивируемых с кинетином . После синтеза он может активировать мутант киназы PINK1 , который в противном случае неактивен в отсутствие усиленного аналога. Неактивный PINK1 участвует в болезни Паркинсона (БП). В контексте БП мутантная пара PINK1-KTP представляет собой ортогональный неофермент-неосубстратный терапевтический препарат. [10]

Группа Shokat также применила подход bump-and-hole для разработки селективных, проницаемых для клеток ингибиторов bumped мутантных киназ. Для киназы I338G v-Src было разработано производное 4-амино-l- трет -бутил-3-( p -метилфенил)пиразоло[3,4-d]пиримидина (PP1) под названием p - t ButPhe-PP1 для селективного ингибирования; стерическая масса исключала связывание с диким типом киназы v-Src. В клеточных линиях млекопитающих активная киназа v-Src необходима для трансформации вирусом саркомы Рауса . В клеточных линиях, экспрессирующих киназу I338G v-Src и трансфицированных RSV, обработка p - t ButPhe-PP1 вызывала обратную трансформацию, что предполагает ингибирование мутанта киназы. [11] Позднее группа разработала усиленные ингибиторы 1-нафтил PP1 (NA-PP1) и 1-метилнафтил PP1 (MN-PP1), которые ингибировали модифицированные дыркой дрожжевые киназы со значениями IC50 в низких наномолярных концентрациях. [12]

БЭТ-белки

Усиленный ингибитор ET имеет селективность к L94A BET BD из-за стерической комплементарности. Неусиленный ингибитор I-BET будет беспорядочно связывать BD. [13]

Семейство белков BET (Bromodomains and Extra Terminal) содержит консервативные мотивы, известные как бромодомены (BD), ответственные за распознавание ацетилированного лизина на нуклеосомных гистонах. [14] Недавно четыре члена семейства BET, BRD2, 3, 4 и BRDT, каждый из которых содержит два бромодомена, были идентифицированы как важные регуляторы транскрипции. [15] Для того чтобы исследовать специфичные для бромодомена функции членов семейства BET, были разработаны малые молекулярные ингибиторы JQ1 и I-BET, но у них отсутствовала селективность между и внутри BET (между BD на одном белке). [16] Лаборатория Алессио Чулли создала пары «выступ-впадина», состоящие из ET, производного I-BET с этильным выступом, и различных членов семейства BET с мутацией L94A в их BD1. [13] Было обнаружено, что ET имеет в 160 раз большую специфичность к модифицированному отверстием BD1 мутантов BET по сравнению с BD белков BET дикого типа, что дает BD-специфическое ингибирование. Пары выпуклости и отверстия BD-ET использовались для того, чтобы показать, что селективное ингибирование BD1 в белке BET нарушает взаимодействие хроматина. Недавно группа Ciulli разработала новую пару выпуклости и отверстия, состоящую из мутантов BET с мутацией Leu в Val в BD и увеличенного ингибитора малой молекулы 9-ME-1. Было обнаружено, что этот увеличенный ингибитор имеет IC50 200 нМ и более чем 100-кратную специфичность к мутанту L/V BET BD по сравнению с BD дикого типа. Эта пара выпуклости и отверстия позволила избирательно ингибировать определенные BD в определенных белках BET, проясняя их роль в клетках человека. Было обнаружено, что в то время как BD1 важен для локализации белков BET в хроматине, BD2 регулирует экспрессию генов путем связывания и привлечения негистоновых ацетилированных белков, таких как факторы транскрипции. [17]

Гликозидазы

Схематическое изображение пролекарства с выпуклостью и фермента с измененной дыркой, высвобождающего лекарство только в присутствии пары выпуклость-дырка. [18]

Гликозидазы — это семейство ферментов, катализирующих гидролиз гликозидных связей . Эти ферменты могут расщеплять гликаны из гликозилированных белков, что является одной из наиболее распространенных форм посттрансляционной модификации . В недавнем терапевтическом применении метода «бум-энд-дырка» модифицированная дыркой галактозидаза была объединена с «бум-галактозил-пролекарством». Джингли Хоу и его коллеги стремились доставить оксид азота , важный мессенджер для содействия процессам роста тканей, таким как ангиогенез и васкулогенез , пространственно-временным контролируемым образом. Они выбрали систему пролекарства , в которой препарат, высвобождающий NO, NONOate , изначально гликозилирован. Как только гликозилированный NONOate попадает в клетки и подвергается воздействию гликозидаз, высвобождается NO. Однако неспецифическое для тканей системное высвобождение NO, которое может снизить терапевтическую эффективность и вызвать вредные побочные эффекты, из этих пролекарств было очевидно из-за широкого распространения эндогенных гликозидаз. Чтобы обойти это, Хоу и др. разработали усиленный пролекарство посредством метилирования O6 галактозной части галактозил-NONOate. Они сконструировали соответствующий мутант β-галактозидазы с измененным отверстием, A4-β-GalH363A со специфичностью к усиленному галактозил-NONOate. Усиленное пролекарство избежало расщепления β-галактозидазой дикого типа из-за метилированного O6 галактозной части и строгой региоселективности гликозидаз. NO высвобождался в тканях только в присутствии как увеличенного галактозил-NONOate, так и модифицированного мутанта β-галактозидазы с дыркой, что давало пространственно-временной контроль доставки. Хоу и др. обнаружили значительное увеличение терапевтической эффективности доставки NO через инженерную систему с дыркой и выпуклостью по сравнению с немодифицированным пролекарством в моделях ишемии задних конечностей у крыс и острого повреждения почек у мышей. [18]

Н-Ацетилгалактозаминилтрансферазы

Модифицированные дыркой BH GalNac-Ts в паре с аналогами UDP-GalNac маркируют субстраты GalNac T для визуализации с помощью клик-химии. [19]

Семейство N- ацетилгалактозаминилтрансфераз (GalNac Ts) переносит N-ацетилгалактозамин в боковые цепи Ser/Thr ( O-связанное гликозилирование ) своих субстратов, используя UDP-GalNac в качестве кофактора. Как и в случае с киназами, профилирование субстрата для конкретных изоформ GalNac Ts было труднодостижимым. Отсутствие консенсусной последовательности гликозилирования и изменчивость разработки гликанов представляют собой проблему для изучения гликопротеинов O-GalNac. Кроме того, стратегии нокаута GalNac-трансферазы неэффективны, поскольку активность изоформ в семействе является как избыточной, так и конкурентной, так что компенсация происходит при KO. Недавно Шуманн и др. применили стратегию «выпуклости и дырки» для разработки содержащих выпуклости алкин-содержащих аналогов UDP -GalNac и модифицированных двойным отверстием мутантов I253A/L310A GalNac Ts (BH GalNac Ts). Аналоги UDP-алкинов были специфичны для комплементарных BH GalNac Ts, которые, как было показано, сохраняют биохимическую компетентность дикого типа GalNac Ts в отношении структуры, локализации и субстратной специфичности. Эта пара «выпуклости и дырки» прикрепила биоортогональную метку, визуализируемую с помощью клик-химии , к субстратам различных изоформ GalNac T, деконволюционируя профили субстрата, при этом демонстрируя сложность разработки гликанов в секреторном пути. [19]

Ссылки

  1. ^ ab Islam, Kabirul (октябрь 2018 г.). «Тактика Bump-and-Hole: расширение сферы применения химической генетики». Cell Chemical Biology . 25 (10): 1171– 1184. doi : 10.1016/j.chembiol.2018.07.001. PMC  6195450. PMID  30078633 .
  2. ^ Каст, Питер; Хеннеке, Хауке (ноябрь 1991 г.). «Аминокислотная субстратная специфичность фенилаланил-тРНК-синтетазы Escherichia coli, измененная различными мутациями». Журнал молекулярной биологии . 222 (1): 99– 124. doi :10.1016/0022-2836(91)90740-W. PMID  1942071.
  3. ^ Лю, Чанг С.; Шульц, Питер Г. (2010-06-07). «Добавление новых химических веществ в генетический код». Annual Review of Biochemistry . 79 (1): 413– 444. doi :10.1146/annurev.biochem.052308.105824. ISSN  0066-4154. PMID  20307192.
  4. ^ Belshaw, Peter J.; Schoepfer, Joseph G.; Liu, Karen-Qianye; Morrison, Kim L.; Schreiber, Stuart L. (1995-10-16). "Рациональный дизайн ортогональных комбинаций рецепторов и лигандов". Angewandte Chemie International Edition на английском языке . 34 (19): 2129– 2132. doi :10.1002/anie.199521291. ISSN  0570-0833.
  5. ^ Шрайбер, Стюарт Л. (1998-08-01). «Химическая генетика как результат страсти к синтетической органической химии». Биоорганическая и медицинская химия . 6 (8): 1127– 1152. doi :10.1016/S0968-0896(98)00126-6. ISSN  0968-0896. PMID  9784856.
  6. ^ Белшоу, Питер Дж.; Шрайбер, Стюарт Л. (февраль 1997 г.). «Клеточно-специфическое ингибирование кальциневрина модифицированным циклоспорином». Журнал Американского химического общества . 119 (7): 1805– 1806. doi :10.1021/ja9636146. ISSN  0002-7863.
  7. ^ Ли, Минджунг; Ли, Цзя; Лян, И; Ма, Голинь; Чжан, Цзисян; Хэ, Лянь; Лю, Юйлян; Ли, Цянь; Ли, Миньонг; Сан, Дэцян; Чжоу, Юбин (2017-04-05). «Сконструированный фермент Split-TET2 для индуцируемого эпигенетического ремоделирования». Журнал Американского химического общества . 139 (13): 4659– 4662. doi :10.1021/jacs.7b01459. ISSN  0002-7863. PMC 5385525. PMID  28294608 . 
  8. ^ ab Liu, Yi; Shah, Kavita; Yang, Feng; Witucki, Laurie; Shokat, Kevan M. (февраль 1998 г.). «Инженерия протеинкиназ семейства Src с неестественной нуклеотидной специфичностью». Химия и биология . 5 (2): 91– 101. doi : 10.1016/S1074-5521(98)90143-0 . PMID  9495830.
  9. ^ Ubersax, Jeffrey A.; Woodbury, Erika L.; Quang, Phuong N.; Paraz, Maria; Blethrow, Justin D.; Shah, Kavita; Shokat, Kevan M.; Morgan, David O. (октябрь 2003 г.). «Цели циклин-зависимой киназы Cdk1». Nature . 425 (6960): 859– 864. Bibcode :2003Natur.425..859U. doi :10.1038/nature02062. ISSN  0028-0836. PMID  14574415. S2CID  4391711.
  10. ^ Hertz, Nicholas T.; Berthet, Amandine; Sos, Martin L.; Thorn, Kurt S.; Burlingame, Al L.; Nakamura, Ken; Shokat, Kevan M. (август 2013 г.). «Нео-субстрат, усиливающий каталитическую активность киназы PINK1, связанной с болезнью Паркинсона». Cell . 154 (4): 737– 747. doi :10.1016/j.cell.2013.07.030. PMC 3950538 . PMID  23953109. 
  11. ^ Бишоп, Энтони К.; Шах, Кавита; Лю, Йи; Витуки, Лори; Кунг, Чи-юнь; Шокат, Кеван М. (февраль 1998 г.). «Разработка аллель-специфических ингибиторов для исследования сигнализации протеинкиназы». Current Biology . 8 (5): 257– 266. doi : 10.1016/S0960-9822(98)70198-8 . PMID  9501066.
  12. ^ Бишоп, Энтони К.; Юберсакс, Джеффри А.; Петш, Дея Т.; Матеос, Дина П.; Грей, Натанаэль С.; Блетроу, Джастин; Шимизу, Эйдзи; Циен, Джо З.; Шульц, Питер Г.; Роуз, Марк Д.; Вуд, Джон Л. (сентябрь 2000 г.). «Химический переключатель для чувствительных к ингибиторам аллелей любой протеинкиназы». Nature . 407 (6802): 395– 401. Bibcode :2000Natur.407..395B. doi :10.1038/35030148. ISSN  0028-0836. PMID  11014197. S2CID  4430890.
  13. ^ аб Бауд, MGJ; Линь-Шяо, Э.; Кардоте, Т.; Таллант, К.; Пщибул, А.; Чан, К.-Х.; Ценгерле, М.; Гарсия-младший; Кван, ТТ-Л.; Фергюсон, FM; Чулли, А. (31 октября 2014 г.). «Методический подход к инженерной контролируемой селективности химических зондов с бромодоменом BET». Наука . 346 (6209): 638–641 . Бибкод : 2014Sci...346..638B. дои : 10.1126/science.1249830. ISSN  0036-8075. ПМЦ 4458378 . ПМИД  25323695. 
  14. ^ Филиппакопулос, Панагис; Ци, Цзюнь; Пико, Сара; Шен, Яо; Смит, Уильям Б.; Федоров Олег; Морс, Элизабет М.; Китс, Трейси; Хикман, Тайлер Т.; Феллетар, Ильдико; Филпотт, Мартин (декабрь 2010 г.). «Селективное ингибирование бромодоменов BET». Природа . 468 (7327): 1067–1073 . Бибкод : 2010Natur.468.1067F. дои : 10.1038/nature09504. ISSN  0028-0836. ПМК 3010259 . ПМИД  20871596. 
  15. ^ Ши, Цзянь; Ван, Ифань; Цзэн, Лэй; У, Яди; Дэн, Цзюн; Чжан, Цян; Линь, Ивэй; Ли, Цзюньлинь; Кан, Тебанг; Тао, Минь; Русинова, Елена (февраль 2014 г.). «Нарушение взаимодействия BRD4 с диацетилированным твистом подавляет опухолеобразование при базально-подобном раке груди». Cancer Cell . 25 (2): 210– 225. doi :10.1016/j.ccr.2014.01.028. PMC 4004960 . PMID  24525235. 
  16. ^ Филиппакопулос, Панагис; Ци, Цзюнь; Пико, Сара; Шен, Яо; Смит, Уильям Б.; Федоров Олег; Морс, Элизабет М.; Китс, Трейси; Хикман, Тайлер Т.; Феллетар, Ильдико; Филпотт, Мартин (декабрь 2010 г.). «Селективное ингибирование бромодоменов BET». Природа . 468 (7327): 1067–1073 . Бибкод : 2010Natur.468.1067F. дои : 10.1038/nature09504. ISSN  0028-0836. ПМК 3010259 . ПМИД  20871596. 
  17. ^ Runcie, AC; Zengerle, M.; Chan, K.-H.; Testa, A.; van Beurden, L.; Baud, MGJ; Epemolu, O.; Ellis, LCJ; Read, KD; Coulthard, V.; Brien, A. (2018). «Оптимизация подхода «bump-and-hole» к аллель-селективному ингибированию бромодомена BET». Chemical Science . 9 (9): 2452– 2468. doi :10.1039/C7SC02536J. ISSN  2041-6520. PMC 5909127 . PMID  29732121. 
  18. ^ Аб Хоу, Джингли; Пан, Йива; Чжу, Дашуай; Фань, Юэюань; Фэн, Говей; Вэй, Юнчжэнь; Ван, Хэ; Цинь, Кан; Чжао, Тьечан; Ян, Цян; Чжу, Ян (февраль 2019 г.). «Направленная доставка оксида азота через пару фермент-пролекарство на основе «шишек и дырок». Химическая биология природы . 15 (2): 151–160 . doi : 10.1038/s41589-018-0190-5. ISSN  1552-4450. PMID  30598545. S2CID  58561892.
  19. ^ ab Шуманн, Бенджамин; Малакер, Стейси Элис; Висновски, Саймон Питер; Дебетс, Марьок Фрукье; Агбей, Энтони Джон; Фернандес, Даниэль; Вагнер, Лорен Ян Сарбо; Линь, Лян; Ли, Чжэнь; Чой, Джунвон; Фокс, Дуглас Майкл (апрель 2020 г.). «Bump-and-Hole Engineering Identifies Specific Substrates of Glycosyltransferases in Living Cells». Molecular Cell . 78 (5): 824–834.e15. doi : 10.1016/j.molcel.2020.03.030 . PMC 7276986 . PMID  32325029. 
Получено с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Bump_and_hole&oldid=1214406472"