Бимолекулярная флуоресцентная комплементация

Формирование белкового комплекса с использованием BiFC. Сначала происходит взаимодействие между белком A и белком B, затем следует повторное формирование и флуоресценция флуоресцентного репортерного белка.

Бимолекулярная флуоресцентная комплементация (также известная как BiFC ) — это технология, обычно используемая для проверки взаимодействия белков . Она основана на ассоциации фрагментов флуоресцентного белка, которые прикреплены к компонентам одного и того же макромолекулярного комплекса. Белки, которые, как предполагается, взаимодействуют, сливаются с развернутыми комплементарными фрагментами флуоресцентного репортерного белка и экспрессируются в живых клетках. Взаимодействие этих белков приведет к сближению флуоресцентных фрагментов, что позволит репортерному белку преобразоваться в его нативную трехмерную структуру и испустить свой флуоресцентный сигнал. [1] Этот флуоресцентный сигнал может быть обнаружен и локализован внутри клетки с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа , который позволяет визуализировать флуоресценцию в клетках. Кроме того, интенсивность испускаемой флуоресценции пропорциональна силе взаимодействия, при этом более высокие уровни флуоресценции указывают на близкие или прямые взаимодействия, а более низкие уровни флуоресценции предполагают взаимодействие внутри комплекса. [2] Таким образом, посредством визуализации и анализа интенсивности и распределения флуоресценции в этих клетках можно определить как местоположение, так и партнеров по взаимодействию интересующих белков.

История

Биохимическая комплементарность впервые была описана в расщепленной субтилизином бычьей панкреатической рибонуклеазе , а затем расширена с использованием мутантов β-галактозидазы , что позволило клеткам расти на лактозе. [3] [4] [5]

Признание способности многих белков спонтанно собираться в функциональные комплексы, а также способности фрагментов белков собираться в результате спонтанной функциональной комплексной сборки партнеров по взаимодействию, с которыми они слиты, было позднее обнаружено для фрагментов убиквитина во взаимодействиях белков дрожжей. [6]

В 2000 году Гош и др. разработали систему, которая позволила повторно собрать зеленый флуоресцентный белок ( GFP ) с использованием антипараллельной лейциновой молнии в клетках E. coli . [7] Это было достигнуто путем разделения GFP на C- и N-концевые фрагменты GFP. Поскольку фрагмент GFP был прикреплен к каждой лейциновой молнии с помощью линкера, гетеродимеризация антипараллельной лейциновой молнии привела к восстановленному или переформированному белку GFP, который можно было визуализировать. Успешный флуоресцентный сигнал показал, что отдельные фрагменты пептида GFP смогли правильно повторно собраться и достичь третичного сворачивания . Поэтому было постулировано, что с помощью этой техники фрагментированный GFP можно использовать для изучения взаимодействия пар белок-белок, у которых их N-C-концы находятся в непосредственной близости.

После демонстрации успешного восстановления фрагментов флуоресцентного белка в клетках млекопитающих, Ху и др . описали использование фрагментированного желтого флуоресцентного белка ( YFP ) в исследовании взаимодействий факторов транскрипции семейства bZIP и Rel . [8] Это был первый отчет о регуляции взаимодействия белков bZIP областями за пределами домена bZIP , регуляции субъядерной локализации доменов bZIP Fos и Jun их различными взаимодействующими партнерами и модуляции транскрипционной активации белков bZIP и Rel посредством взаимных взаимодействий. Кроме того, это исследование было первым отчетом о технике in vivo , теперь известной как анализ бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC), для предоставления информации о структурной основе образования белковых комплексов посредством обнаружения флуоресценции, вызванной сборкой фрагментов флуоресцентного репортерного белка, привязанных к взаимодействующим белкам. [8] [9]

Флуоресцентная маркировка

Активация флуорофора происходит посредством реакции автокаталитической циклизации, которая происходит после того, как белок был правильно свёрнут. [10] Этому способствовало успешное восстановление флуорофора YFP из фрагментов белка, которые были слиты с взаимодействующими белками в течение 8 часов после трансфекции, о чём сообщалось в 2002 году. [8]

Рабочий процесс

Рабочий процесс для BiFC

Выбор системы производства слитого белка

Существуют различные системы производства , которые могут быть использованы для полученного белка слияния. Транзиентная экспрессия гена используется для идентификации белок-белковых взаимодействий in vivo , а также для субклеточной локализации комплекса BiFC. Однако следует проявлять осторожность в отношении избыточной экспрессии белка, поскольку это может исказить как предпочтительную локализацию, так и преобладающие образованные белковые комплексы. Вместо этого следует использовать слабые промоторы , использование низких уровней плазмидной ДНК при трансфекции и плазмидные векторы, которые не реплицируются в клетках млекопитающих, для экспрессии белков на их эндогенных уровнях или вблизи них для имитации физиологической клеточной среды. [11] Кроме того, важен тщательный выбор флуоресцентного белка, поскольку различные флуоресцентные белки требуют различных клеточных сред. Например, GFP можно использовать в клетках E. coli , в то время как YFP используется в клетках млекопитающих. [12]

Стабильные клеточные линии с вектором экспрессии, интегрированным в их геном, обеспечивают более стабильную экспрессию генов в популяции клеток, что приводит к более последовательным результатам. [1]

Определение мест слияния

При выборе места слияния линкера на поверхности белка необходимо учитывать три основных фактора. Во-первых, фрагменты флуоресцентного белка должны быть способны связываться друг с другом при взаимодействии связанных с ними белков. [11] Структурная информация и местоположение поверхности взаимодействия могут быть полезны при определении места слияния с линкером, хотя эта информация не является необходимой, поскольку можно отсортировать множественные комбинации и перестановки. [11] Во-вторых, создание белка слияния не должно существенно изменять локализацию, стабильность или экспрессию белков, с которыми связаны фрагменты, по сравнению с эндогенными белками дикого типа . [11] Наконец, добавление слияния флуоресцентного фрагмента не должно влиять на биологическую функцию белка, желательно проверенную с помощью анализов, которые оценивают все известные функции белков. [11]

Проектирование линкеров

Линкер — это короткая аминокислотная последовательность , которая связывает фрагмент флуоресцентного репортерного белка с интересующим белком, образуя слитый белок. При проектировании последовательности линкера необходимо убедиться, что линкер достаточно растворим и длинный, чтобы обеспечить фрагментам флуоресцентного белка гибкость и свободу движения, так что фрагмент и его фрагмент-партнер будут сталкиваться достаточно часто, чтобы восстанавливаться во время взаимодействия их соответствующих слитых белков. [1] Хотя это не документировано, возможно, что длина или последовательность линкера могут влиять на комплементацию некоторых белков. [11] Сообщаемые последовательности линкеров RSIAT и RPACKIPNDLKQKVMNH (код одной аминокислоты) и AAANSSIDLISVPVDSR (Sigma) успешно использовались в экспериментах BiFC. [8] [13]

Создание правильных векторов экспрессии плазмид

При проектировании плазмидных векторов для экспрессии интересующих белков конструкция должна быть способна экспрессировать белки, которые способны образовывать белки слияния с фрагментами флуоресцентного белка, не нарушая функции белка. Кроме того, ожидаемый белковый комплекс должен быть способен принимать стабилизацию взаимодействия фрагмента флуоресцентного белка, не влияя на функцию белкового комплекса или изучаемую клетку. Многие фрагменты флуоресцентного белка, которые объединяются несколькими способами, могут быть использованы в BiFC. [8] [13] Как правило, YFP рекомендуется использовать в качестве репортерного белка, расщепленного по остатку 155 (N-конец, состоящий из остатков 1–154, и C-конец, состоящий из остатков 155–238) или, в частности, по остатку 173, поскольку эти наборы фрагментов высокоэффективны в своей комплементарности при слиянии со многими взаимодействующими белками и производят низкие уровни флуоресценции при слиянии с невзаимодействующими белками. Предполагается, что каждый целевой белок сливается с N- и C-концевыми фрагментами флуоресцентного репортерного белка по очереди, и что фрагменты сливаются с каждым из N- и C-концевых концов целевых белков. Это позволит в общей сложности восемь различных перестановок с тестируемыми взаимодействиями: [1]

N-концевой фрагмент, слитый с N-концевым белком 1 + C-концевой фрагмент, слитый с N-концевым белком 2
N-концевой фрагмент, слитый с N-концевым белком 1 + C-концевой фрагмент, слитый с C-концевым белком 2
N-концевой фрагмент, слитый с C-концевым белком 1 + C-концевой фрагмент, слитый с N-концевым белком 2
N-концевой фрагмент, слитый с C-концевым белком 1 + C-концевой фрагмент, слитый с C-концевым белком 2
C-концевой фрагмент, слитый с N-концевым белком 1 + N-концевой фрагмент, слитый с C-концевым белком 2
C-концевой фрагмент, слитый с N-концевым белком 1 + N-концевой фрагмент, слитый с C-концевым белком 2
C-концевой фрагмент, слитый с C-концевым белком 1 + N-концевой фрагмент, слитый с N-концевым белком 2
C-концевой фрагмент, слитый с С-концевой белок 1 + N-концевой фрагмент, слитый с С-концевым белком 2

Выбор подходящей системы культивирования клеток

Как уже говорилось ранее, важно убедиться, что флуоресцентный репортерный белок, используемый в BiFC, является подходящим и может быть экспрессирован в выбранной системе клеточной культуры , поскольку не все репортерные белки могут флуоресцировать или визуализироваться во всех модельных системах .

Выбор соответствующих элементов управления

Фрагменты флуоресцентного белка могут ассоциироваться и флуоресцировать с низкой эффективностью при отсутствии специфического взаимодействия. Поэтому важно включить контроли , чтобы гарантировать, что флуоресценция от восстановления флуоресцентного репортерного белка не вызвана неспецифическим контактом. [14]

Некоторые контроли включают фрагменты флуорофора, связанные с невзаимодействующими белками, поскольку наличие этих слияний имеет тенденцию уменьшать неспецифическую комплементарность и ложноположительные результаты. [7]

Другой контроль создается путем связывания фрагмента флуоресцентного белка с белками с мутированными поверхностями взаимодействия. [8] [13] Пока флуоресцентный фрагмент сливается с мутированными белками таким же образом, как и белок дикого типа, а уровни экспрессии генов и локализация не затронуты мутацией , это служит сильным отрицательным контролем, поскольку мутантные белки и, следовательно, флуоресцентные фрагменты не должны взаимодействовать.

Внутренние контроли также необходимы для нормализации различий в эффективности трансфекции и экспрессии генов в разных клетках. Это достигается путем котрансфекции клеток с плазмидами, кодирующими интересующие белки слияния, а также целый (не фрагментированный) белок, который флуоресцирует на другой длине волны от флуоресцентного репортерного белка. Во время визуализации определяются интенсивности флуоресценции комплекса BiFC и внутреннего контроля, который после вычитания фонового сигнала становится отношением. Это отношение представляет эффективность BiFC и может сравниваться с другими отношениями для определения относительной эффективности образования различных комплексов. [11]

Трансфекция клеток

После того, как белки слияния и контроли были разработаны и созданы в их соответствующей системе экспрессии, плазмиды должны быть трансфицированы в клетки, которые будут изучаться. После трансфекции необходимо подождать, обычно около восьми часов, чтобы дать время белкам слияния взаимодействовать, а их связанным фрагментам флуоресцентного репортерного белка — ассоциироваться и флуоресцировать. [8]

Визуализация и анализ

По истечении достаточного времени для взаимодействия и флуоресценции белков слияния и их связанных флуоресцентных фрагментов клетки можно наблюдать под инвертированным флуоресцентным микроскопом, который может визуализировать флуоресценцию в клетках. Хотя интенсивность флуоресценции комплексов BiFC обычно составляет <10% от той, которая производится экспрессией интактных флуоресцентных белков, чрезвычайно низкая автофлуоресценция в видимом диапазоне большинства клеток часто делает сигнал BiFC на порядки выше фоновой флуоресценции. [15]

Если флуоресценция обнаруживается при экспрессии белков слияния, но отсутствует или значительно снижена после экспрессии мутированного отрицательного контроля, то, скорее всего, происходит специфическое взаимодействие между двумя целевыми белками, представляющими интерес. Однако, если интенсивность флуоресценции не существенно отличается между мутированным отрицательным контролем белка слияния и его аналогом дикого типа, то флуоресценция, скорее всего, вызвана неспецифическими взаимодействиями белков, поэтому следует протестировать другую комбинацию конформаций белков слияния.

Если флуоресценция не обнаружена, взаимодействие между интересующими белками все еще может существовать, поскольку создание белка слияния может изменить структуру или поверхность взаимодействия целевого белка, или фрагменты флуоресценции могут быть физически неспособны ассоциироваться. Чтобы убедиться, что этот результат не является ложноотрицательным , что нет взаимодействия, взаимодействие белков должно быть проверено в ситуации, когда для комплементации и активации флуоресценции требуется внешний сигнал. В этом случае, если внешний сигнал не вызывает ассоциацию фрагментов флуоресценции, вероятно, белки не взаимодействуют или существует физическое препятствие для комплементации флуоресценции. [11]

Сильные стороны

Соответствующий биологический контекст

Белки взаимодействуют с различными белковыми партнерами и другими макромолекулами для достижения функций, которые поддерживают различные функции в клетках, которые поддерживают выживание организма. Выявление этих взаимодействий может дать ключ к их влиянию на клеточные процессы. Поскольку эти взаимодействия могут зависеть как от внутренней среды, так и от внешних стимулов, изучение этих взаимодействий in vivo и на эндогенных уровнях, как рекомендуется в BiFC, обеспечивает физиологически релевантный контекст, из которого можно сделать выводы о взаимодействиях белков.

Прямая визуализация

BiFC позволяет напрямую визуализировать белковые взаимодействия в живых клетках с ограниченным клеточным возмущением , а не полагаться на вторичные эффекты или окрашивание экзогенными молекулами, которые могут не распределяться равномерно. [1] Это, а также возможность наблюдать за живыми клетками в течение длительных периодов времени, становится возможным благодаря сильной собственной флуоресценции реконструированного репортерного белка, что снижает вероятность неправильного считывания, связанного с процессом выделения белка. [1] [16]

Чувствительность

В отличие от многих анализов взаимодействия белков in vivo , BiFC не требует, чтобы белковые комплексы были образованы большой долей белков или в стехиометрических пропорциях. Вместо этого BiFC может обнаруживать взаимодействия между субпопуляциями белков , слабые взаимодействия и белки с низкой экспрессией из-за стабильной комплементарности флуоресцентного репортерного белка. [12] [17] Кроме того, сообщалось об успешном восстановлении флуоресцентного белка для белковых партнеров, находящихся на расстоянии более 7 нм друг от друга, при условии, что линкеры, связывающие фрагмент флуорофора с интересующим белком, обладают гибкостью, необходимой для ассоциации с соответствующим фрагментом. [14] Кроме того, сила взаимодействия белков может быть количественно определена по изменениям силы флуоресцентного сигнала. [2]

Пространственное разрешение

BiFC позволяет измерять пространственные и временные изменения в белковых комплексах, даже в ответ на активирующие и ингибирующие препараты и на субклеточном уровне, обеспечивая наивысшее пространственное разрешение анализов взаимодействия белок-белок in vivo . [8] [18] [19]

Нет специального оборудования

BiFC не требует специального оборудования, поскольку визуализация возможна с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа, который может обнаруживать флуоресценцию в клетках. [14] Кроме того, анализ не требует сложной обработки данных или коррекции для других источников флуоресценции. [8]

Структурная информация не требуется

BiFC может быть выполнен без структурной информации о партнерах взаимодействия, пока фрагменты флуоресцентного репортерного белка могут ассоциироваться внутри комплекса, поскольку можно скринировать множественные комбинации белков слияния. Это связано с предположением, что, поскольку функции белка воспроизводятся в контексте in vivo , структура комплекса будет напоминать структуру интактных белков, наблюдаемых физиологически. [15]

Множественные приложения

Технология BiFC была усовершенствована и расширена, чтобы включить возможности одновременной визуализации нескольких белковых комплексов в одной клетке, взаимодействий РНК/белок, быстрого обнаружения изменений в путях генной трансдукции, демонстрации скрытых фенотипов препаратов, когда прогнозируемый результат лечения (т. е. гибель клеток, дифференциация, морфологические изменения) не наблюдается in vivo , изучения образования комплексов в различных клеточных компартментах и ​​картирования поверхностей взаимодействия белков [13] [19] [20] [21] [22]

Ограничения

Обнаружение в реальном времени

Флуоресцентный сигнал вырабатывается только после взаимодействия белков, что обычно занимает несколько часов. Поэтому BiFC не может обеспечить обнаружение взаимодействия белков в реальном времени. Задержка химических реакций для генерации флуорофора также может влиять на динамику диссоциации комплекса и обмена партнерами. [1] [7] [8] [23]

Необратимое образование BiFC

Образование комплекса BiFC обратимо только на начальном этапе повторной сборки флуоресцентного репортерного белка, обычно в течение миллисекунд. После того, как флуорохром был восстановлен, он по существу необратим in vitro . Это предотвращает взаимодействие белков с другими и может нарушить ассоциацию/диссоциацию белковых комплексов в динамическом равновесии . [1]

Независимые ассоциации фрагментов флуоресцентных белков

Фрагменты флуоресцентных белков имеют ограниченную способность к ассоциации независимо от белков, с которыми они слиты. Хотя ассоциация, не зависящая от белка, будет варьироваться в зависимости от идентичности белков слияния и уровней их экспрессии, необходимо обеспечить необходимые и многочисленные элементы управления для различения истинных и ложноположительных взаимодействий белков. Как правило, это ограничение смягчается путем обеспечения того, чтобы интересующие белки слияния были выражены в эндогенных концентрациях. [1]

Изменение структуры белка и стерические помехи

Связывание флуоресцентных фрагментов может изменить сворачивание или структуру интересующего белка, что приводит к устранению поверхностного связывающего участка взаимодействующего белка. Кроме того, расположение флуоресцентных фрагментов может предотвратить восстановление флуорофора посредством стерических помех , хотя стерические помехи можно уменьшить или устранить с помощью линкерной последовательности, которая обеспечивает достаточную гибкость для ассоциации флуоресцентных фрагментов. Таким образом, отсутствие комплементации флуоресценции может быть ложноотрицательным и не обязательно доказывает, что рассматриваемое взаимодействие не происходит.

Облигатные анаэробы

Из-за необходимости молекулярного кислорода для образования флуорофора, BiFC не может использоваться в облигатных анаэробах , которые не могут выживать в присутствии кислорода. Это ограничивает использование BiFC аэробными организмами . [1]

Автофлуоресценция

Автофлуоресценция обычно не является проблемой, поскольку сигнал BiFC будет намного выше фонового. [24] [25] Однако некоторые организмы, особенно apicomplexa , имеют более высокую автофлуоресценцию, что затрудняет применение BiFC к ним. [26] Некоторые грибы, такие как Candida albicans , также имеют высокий автофлуоресцентный фон, но BiFC часто все равно можно выполнить, если использовать надлежащие элементы управления и штаммы. [27] [28]

Использование белков слияния

Поскольку эндогенные белки дикого типа не могут быть визуализированы in vivo , необходимо создать белки слияния и трансфицировать их плазмиды в изучаемые клетки. Эти белки слияния могут не воспроизводить функции, локализацию и взаимодействия, общие для их аналогов дикого типа, что дает неточную картину рассматриваемых белков. Эту проблему можно решить, используя структурную информацию и местоположение сайтов взаимодействия для рациональной идентификации сайтов слияния на интересующих белках, используя соответствующие элементы управления и сравнивая уровни экспрессии и функции белков слияния и дикого типа с помощью вестерн-блоттинга и функциональных анализов. [1]

Температурная зависимость

Хотя низкие температуры способствуют восстановлению флуоресценции, когда фрагменты находятся в непосредственной близости, это может повлиять на поведение целевых белков, что приведет к неточным выводам относительно природы взаимодействия белков и их взаимодействующих партнеров. [17]

Точные взаимоотношения неизвестны.

Поскольку восстановление флуорофора может происходить на расстоянии 7 нм и более, комплементация флуоресценции может указывать как на прямое, так и на косвенное (т.е. в пределах одного комплекса) взаимодействие между слитыми белками флуоресцентных фрагментов. [16]

Приложение

В дополнение к описанной выше проверке белок-белковых взаимодействий, BiFC был расширен и адаптирован для других приложений:

Сборка бактериальных рибосом

Система BiFC была применена для регистрации событий биогенеза рибосом в E.coli . [29] Процесс сборки рибосом включает зарождение рибосомных белков в правильном порядке и ориентации. Нарушения в сборке могут привести к структурным дефектам в рибосомных субъединицах, которые в результате не могут соединиться в правильной ориентации для формирования полностью функциональных рибосом. Таким образом, события соединения субъединиц, сигнализируемые появлением BiFC, являются простым способом мониторинга биогенеза рибосом в отличие от трудоемких методов профилирования полисом.

Многоцветная флуоресценция

Фрагменты флуоресцентных белков, используемые в BiFC, были расширены и теперь включают в себя цвета: синий, голубой, зеленый, желтый, красный, вишневый и Венера . [8] [13] [30] [31] Этот диапазон цветов сделал возможным разработку многоцветного флуоресцентного комплементационного анализа. [13] Эта техника позволяет визуализировать несколько белковых комплексов одновременно в одной и той же клетке. Кроме того, белки обычно имеют большое количество альтернативных партнеров взаимодействия. Поэтому, слияя фрагменты различных флуоресцентных белков с белками-кандидатами, можно изучать конкуренцию между альтернативными партнерами взаимодействия за образование комплекса посредством комплементации фрагментов различных флуоресцентных цветов. [13]

Взаимодействие РНК-связывающих белков

BiFC был расширен, включив в себя изучение взаимодействий РНК-связывающих белков в методе, который Рэкхэм и Браун описали как тримолекулярную флуоресцентную комплементацию (TriFC). [20] В этом методе фрагмент флуоресцентного белка Venus сливается с интересующей мРНК , а комплементарная часть Venus сливается с интересующим РНК-связывающим белком . Подобно BiFC, если мРНК и белок взаимодействуют, белок Venus будет восстановлен и флуоресцировать. Также известный как метод моста РНК, поскольку флуорофор и другие взаимодействующие белки образуют мост между белком и интересующей РНК, это позволяет просто обнаруживать и локализовать взаимодействия РНК-белок внутри живой клетки и обеспечивает простой метод обнаружения прямой или косвенной ассоциации РНК-белок (т. е. внутри комплекса), которую можно проверить с помощью анализа in vitro очищенных соединений или РНК- интерференции мостиковой молекулы(-ок). [20]

Организация путей и каскады передачи сигнала

BiFC можно использовать для связывания генов друг с другом и их функций посредством измерения взаимодействий между белками, которые кодируют гены. [21] [22] Это приложение идеально подходит для новых генов, в которых мало что известно об их эффекторах вверх и вниз по течению , поскольку могут быть созданы новые связи путей. Кроме того, эффекты лекарств, гормонов или делеции или нокдауна интересующего гена, а также последующие эффекты как на силу белок-белковых взаимодействий, так и на местоположение взаимодействия можно наблюдать в течение нескольких секунд. [18] [19]

Комплексообразование в различных клеточных компартментах

BiFC использовался для изучения ядерной транслокации посредством сложной локализации, а также взаимодействий с участием интегральных мембранных белков . [8] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] Таким образом, BiFC является важным инструментом для понимания локализации факторов транскрипции в субклеточных компартментах.

Количественная оценка поверхностей взаимодействия белок-белок

BiFC был объединен с проточной цитометрией (BiFC-FC). Это позволяет картировать поверхности взаимодействия белок-белок посредством введения сайт-направленных или случайных мутаций, которые влияют на образование комплекса. [2]

Сравнение с другими технологиями

Большинство методов, используемых для изучения белок-белковых взаимодействий, основаны на методах in vitro . К сожалению, изучение белков в искусственной системе, за пределами их клеточной среды, сопряжено с рядом трудностей. Например, это может потребовать удаления белков из их обычной клеточной среды. Обработка, необходимая для выделения белка, может повлиять на его взаимодействие с другими белками. Кроме того, выделение белка из внутриклеточной сигнализации и механизмов, которые происходят в нормальной клетке, может дать вводящую в заблуждение картину внутриклеточных и физиологических явлений. [1] Кроме того, белки, изучаемые in vitro, могут изучаться в концентрациях, значительно отличающихся от их обычных уровней распространенности, не обязательно могут эффективно транспортироваться в клетки или могут быть недостаточно избирательными для функционирования в геноме хозяина. [39] [40] [41] [42] Наконец, изучая белки in vitro , невозможно определить влияние конкретных белок-белковых взаимодействий в клетке на функциональные или физиологические последствия.

Другие анализы in vivo, наиболее часто используемые для изучения белок-белковых взаимодействий, включают флуоресцентный резонансный перенос энергии ( FRET ) и дрожжевой двугибридный анализ ( Y2H ). Каждый из этих анализов имеет свои преимущества и недостатки по сравнению с BiFC:

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET)

Флуоресцентный резонансный перенос энергии ( FRET ), также известный как резонансный перенос энергии Фёрстера , резонансный перенос энергии ( RET ) или электронный перенос энергии ( EET ), основан на переносе энергии от возбужденного ( донорного ) хромофора или флуорофора (если хромофоры флуоресцентные) к близлежащему акцептору . В этом методе флуорофоры химически связаны или генетически слиты с двумя белками, предположительно взаимодействующими. Если белки взаимодействуют, это приведет флуорофоры в тесную пространственную близость. Если флуорофоры ориентированы таким образом, что подвергают флуорофоры воздействию друг друга, что обычно обеспечивается при проектировании и построении связи/слияния флуорофор-белок, то перенос энергии от возбужденного донорного флуорофора приведет к изменению интенсивности флуоресценции или времени жизни флуорофоров. [1] [14]

Дрожжи двугибридные (Y2H)

Дрожжевой двугибрид ( Y2H ) — это метод генетического скрининга, который можно использовать для обнаружения физических (связывающих) взаимодействий белок-белок или белок-ДНК . Обычно он применяется в модельном дрожжевом организме Saccharomyces cerevisiae . Он тестирует белок-приманку с (не)известной функцией, который слит, например, с доменом связывания фактора транскрипции GAL4, против потенциально взаимодействующих белков или библиотеки кДНК, которые экспрессируют, например, домен активации GAL4 (добыча). [43] [44]

Сравнение технологий

Сравнение технологийСходство с BiFCПреимуществаНедостатки
ФРЕТСпособность обнаруживать и локализовать участки взаимодействия белков в живых клетках [14]Мгновенный мониторинг взаимодействия белков в реальном времени
Это позволяет обнаруживать белки с кратковременными ассоциациями. [17]

Обратимое взаимодействие флуорофора

Можно обнаружить более сложную динамику взаимодействия (т.е. динамическое равновесие – непрерывное комплексообразование и диссоциация). [14] [15]
Тесная пространственная близость [45]
Потенциально взаимодействующие белки должны находиться близко друг к другу, обычно в пределах 60–100Å, чтобы произошла передача энергии. Напротив, восстановление флуорофора BiFC возможно на расстоянии более 7 нм и требует только, чтобы связь между фрагментом флуорофора и интересующим белком была достаточно гибкой, чтобы обеспечить ассоциацию. [17]

Снижение чувствительности [45]

BiFC обычно более чувствителен из-за стабильной комплементарности белка. Напротив, FRET производит фоновую флуоресценцию, когда акцепторный флуорофор возбуждается. Поэтому необходимо выполнить многочисленные контроли для количественной оценки изменения интенсивности флуоресценции при наличии или отсутствии переноса энергии между флуорофорами. Следовательно, с помощью FRET трудно обнаружить слабые взаимодействия.
Для обнаружения переноса энергии FRET обычно требует более высоких уровней экспрессии генов, поскольку доля белков, образующих комплексы, должна быть достаточно высокой, чтобы вызвать заметное изменение интенсивности флуоресценции донора и акцептора.

Необратимое фотообесцвечивание [46] [47] [48]

Количественная оценка FRET требует необратимого фотообесцвечивания или визуализации времени жизни флуоресценции , которая использует приборы, не имеющие широкого распространения. Это усложняет процесс визуализации, поскольку флуоресценция будет со временем разрушена светом, необходимым для возбуждения флуорофоров.
FRET: взаимодействие между белком A и белком B объединяет два флуоресцентных белка, и между двумя флуоресцентными белками происходит передача энергии
Y2HМетод in vivo, используемый для скрининга взаимодействийГенетический скрининг взаимодействия
Y2H обеспечивает in vivo метод изучения связывания факторов транскрипции на уровне последовательности в эукариотических клетках.
Предполагаемая связь приманки и добычи [14]
Связь между приманкой и добычей часто является предварительной и неоднозначной, поскольку изучение сверхэкспрессированных белков слияния в ядре дрожжей может привести к неспецифическим взаимодействиям и несовместимым системам (например, белки млекопитающих не всегда правильно экспрессируются в клетках дрожжей, белки могут коэкспрессироваться неестественным образом).

Ошибочная активация транскрипции [14]

Ген-репортер может легко активироваться транскрипционно, обеспечивая ложноположительный результат взаимодействия белок-белок или белок-ДНК.

Генетическая комплементарность [4] [5]

Различные аллели одного и того же гена могут приводить к генетической комплементарности, что приводит к неточным взаимодействиям белка с ДНК.

Дрожжи как модельный организм [44] [49]

Y2H происходит в модельном организме Saccharomyces cerevisiae , что затрудняет тестирование белков из других (не дрожжевых) организмов, таких как растения или млекопитающие, или организмов (например, Candida albicans ) с другим использованием кодонов, чем у S. cerevisiae .

Повышенная экспрессия белков [16]

Для Y2H требуется сверхэкспрессия белков, что может исказить анализ данных, поскольку белки могут взаимодействовать с другими белками или ДНК, если они экспрессируются на более высоких, чем обычно, уровнях по сравнению с взаимодействиями, которые происходят на уровнях экспрессии эндогенных генов.

Ядерная локализация [16]

Y2H может использоваться только в ядре, где происходит активация транскрипции. Это одновременно удаляет белок из его физиологически значимой среды, игнорируя роль нормальной среды белка в белковых взаимодействиях, и ограничивает обнаружение белками, которые активны в ядре.
Дрожжи-2-Гибрид: взаимодействие между белком А и белком В активирует транскрипцию

Ссылки

  1. ^ abcdefghijklm Керппола, TK Разработка и реализация анализов бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC) для визуализации белковых взаимодействий в живых клетках. Nat. Protoc. 1, 1278–1286 (2006).
  2. ^ abc Morell, M., Espargaro, A., Aviles, FX & Ventura, S. Изучение и отбор взаимодействий белков in vivo путем сочетания бимолекулярной флуоресцентной комплементации и проточной цитометрии. Nat. Protoc. 3, 22–33 (2008).
  3. ^ Ричардс, Ф. М. О ферментативной активности модифицированной субтилизином рибонуклеазы. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 44, 162–166 (1958).
  4. ^ ab Ульманн, А., Якоб, Ф. и Моно, Ж. Характеристика с помощью комплементации in vitro пептида, соответствующего операторно-проксимальному сегменту структурного гена бета-галактозидазы Escherichia coli. J. Mol. Biol. 24, 339–343 (1967).
  5. ^ ab Ульманн, А., Якоб, Ф. и Моно, Ж. О структуре субъединиц дикого типа в сравнении с комплементарной бета-галактозидазой Escherichia coli. J. Mol. Biol. 32, 1–13 (1968).
  6. ^ Джонссон, Н. и Варшавский, А. Сплит-убиквитин как сенсор взаимодействия белков in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10340-10344 (1994).
  7. ^ abc Ghosh, I., Hamilton, AD & Regan, L. Антипараллельная лейциновая молния-направленная повторная сборка белка: применение к зеленому флуоресцентному белку. Журнал Американского химического общества 122, 5658 (2000).
  8. ^ abcdefghijkl Hu, CD, Chinenov, Y. & Kerppola, TK Визуализация взаимодействий между белками семейства bZIP и Rel в живых клетках с использованием бимолекулярной флуоресцентной комплементации. Mol. Cell 9, 789–798 (2002).
  9. ^ Авилов, Сергей В.; Александрова, Наталия (20 ноября 2018 г.). «Комплементация флуоресцентных белков в микроскопии: применение за пределами обнаружения бимолекулярных взаимодействий». Методы и применение во флуоресценции . 7 (1): 012001. doi : 10.1088/2050-6120/aaef01 . ISSN  2050-6120. PMID  30457122.
  10. ^ Цянь, Р.Ю. Зеленый флуоресцентный белок. Анну. Преподобный Биохим. 67, 509–544 (1998).
  11. ^ abcdefgh "Лаборатория Керппола".
  12. ^ ab Kerppola, TK Дополнительные методы исследования белковых взаимодействий в живых клетках. Nat. Methods 3, 969–971 (2006).
  13. ^ abcdefg Ху, К. Д. и Керппола, ТК Одновременная визуализация множественных белковых взаимодействий в живых клетках с использованием многоцветного флуоресцентного комплементационного анализа. Nat. Biotechnol. 21, 539–545 (2003).
  14. ^ abcdefgh Морелл, М. и др. Мониторинг интерференции белок-белковых взаимодействий in vivo с помощью бимолекулярной флуоресцентной комплементации: случай DnaK. Протеомика 8, 3433–3442 (2008).
  15. ^ abc Kerppola, TK Анализ бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC) как зонд взаимодействия белков в живых клетках. Annu. Rev. Biophys. 37, 465–487 (2008).
  16. ^ abcd "CBI Index". Архивировано из оригинала 9 июня 2010 года . Получено 4 марта 2010 года .
  17. ^ abcd Fan, JY et al. Сплит mCherry как новая красная бимолекулярная флуоресцентная комплементарная система для визуализации белок-белковых взаимодействий в живых клетках. Biochem. Biophys. Res. Commun. 367, 47–53 (2008).
  18. ^ ab Michnick, SW, Ear, PH, Manderson, EN, Remy, I. & Stefan, E. Универсальные стратегии в исследованиях и разработке лекарств на основе анализов комплементации белковых фрагментов. Nat. Rev. Drug Discov. 6, 569–582 (2007).
  19. ^ abc MacDonald, ML et al. Выявление нецелевых эффектов и скрытых фенотипов лекарственных средств в клетках человека. Nat. Chem. Biol. 2, 329–337 (2006).
  20. ^ abc Rackham, O. & Brown, CM Визуализация взаимодействий РНК-белок в живых клетках: FMRP и IMP1 взаимодействуют на мРНК. EMBO J. 23, 3346–3355 (2004).
  21. ^ ab Remy, I., Wilson, IA & Michnick, SW Активация рецептора эритропоэтина путем изменения конформации, вызванного лигандом. Science 283, 990–993 (1999).
  22. ^ ab Remy, I., Montmarquette, A. & Michnick, SW PKB/Akt модулирует сигнализацию TGF-бета посредством прямого взаимодействия с Smad3. Nat. Cell Biol. 6, 358–365 (2004)
  23. ^ Magliery, TJ et al. Обнаружение белок-белковых взаимодействий с помощью зеленой флуоресцентной ловушки повторной сборки фрагментов белка: область применения и механизм. J. Am. Chem. Soc. 127, 146–157 (2005).
  24. ^ Чен, Хонг; Видмер, Стефани; Ханиг, Саха; Энтцерот, Рольф; Курт, Майкл (2013). «Развитие гамонтов и ооцист Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa) в первичных фетальных клетках крысы». Журнал исследований паразитологии . 2013 : 591520. doi : 10.1155/2013/591520 . PMC 3703804. PMID  23862053 . 
  25. ^ Керппола, Том К (2008). «АНАЛИЗ БИМОЛЕКУЛЯРНОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ КОМПЛЕМЕНТАЦИИ (BiFC) КАК ИЗМЕРЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ БЕЛКОВ В ЖИВЫХ КЛЕТКАХ». Annual Review of Biophysics . 37 : 465–87. doi :10.1146/annurev.biophys.37.032807.125842. PMC 2829326. PMID  18573091 . 
  26. ^ Varea, M; Clavel, A; Doiz, O; Castillo, FJ; Rubio, MC; Gómez-Lus, R (1 декабря 1998 г.). «Флуоресценция фуксина и автофлуоресценция в ооцистах Cryptosporidium, Isospora и Cyclospora». Международный журнал паразитологии . 28 (12): 1881–1883. doi :10.1016/S0020-7519(98)00146-5. ISSN  0020-7519. PMID  9925267.
  27. ^ Суботич, Ана; Суиннен, Эрвин; Демуайзер, Лисбет; Де Кеерсмекер, Эрлинде; Мизуно, Хидеаки; Турню, Элен; Ван Дейк, Патрик (2017). «Инструмент дополнения бимолекулярной флуоресценции для идентификации белок-белковых взаимодействий у Candida albicans». G3: Гены, геномы, генетика . 7 (10): 3509–3520. дои : 10.1534/g3.117.300149. ПМЦ 5633398 . ПМИД  28860184. 
  28. ^ Диас, Джакомо; Полонелли, Лучано; Конти, Стефания; Мессана, Ирен; Кабрас, Тициана; Путцолу, Мартина; Фальчи, Анжела Мария; Фадда, Мария Элизабетта; Козентино, София; Изола, Рафаэлла (2005). «Митохондриальные изменения и автофлуоресцентная конверсия Candida albicans, индуцированная гистатинами». Микроскопические исследования и техника . 66 (5): 219–28. дои : 10.1002/jemt.20161. PMID  15940680. S2CID  41048574.
  29. ^ Шарма, Химансю; Ананд, Баскаран (7 июля 2016 г.). «Флуоресцентная бимолекулярная комплементация позволяет легко обнаружить дефекты сборки рибосом в Escherichia coli». RNA Biology . 13 (9): 872–882. ​​doi :10.1080/15476286.2016.1207037. PMC 5014008 . PMID  27388791. 
  30. ^ Jach,G.; Pesch,M.; Richter,K.; Frings,S.; Uhrig,JF Улучшенный mRFP1 добавляет красный цвет к бимолекулярной флуоресцентной комплементации. Nat. Methods. 3, 597–600 (2006)
  31. ^ Shyu,YJ, Liu,H., Deng,X., Hu,CD Идентификация новых фрагментов флуоресцентных белков для бимолекулярного флуоресцентного комплементационного анализа в физиологических условиях. BioTechniques. 40, 61–66 (2006).
  32. ^ de Virgilio, M., Kiosses, WB & Shattil, SJ Проксимальные, селективные и динамические взаимодействия между интегрином alphaIIbbeta3 и протеинтирозинкиназами в живых клетках. J. Cell Biol. 165, 305–311 (2004).
  33. ^ Тонг, Э. Х. и др. Регуляция ядерно-цитоплазматического транспорта фактора транскрипции OREBP/TonEBP/NFAT5. J. Biol. Chem. 281, 23870-23879 (2006).
  34. ^ Лопес-Хименес, Дж. Ф., Каналс, М., Педиани, Дж. Д. и Миллиган, Г. Альфа-1b-адренорецептор существует как олигомер высшего порядка: эффективная олигомеризация необходима для созревания рецептора, доставки на поверхность и функционирования. Mol. Pharmacol. 71, 1015–1029 (2007).
  35. ^ Накахара, С., Хоган, В., Инохара, Х. и Раз, А. Импортин-опосредованная ядерная транслокация галектина-3. J. Biol. Chem. 281, 39649-39659 (2006).
  36. ^ Лю, Х. и др. Взаимная регуляция c-Jun и ATF2 путем транскрипционной активации и субклеточной локализации. EMBO J. 25, 1058–1069 (2006).
  37. ^ Gwozdz, T. et al. EcR и Usp, компоненты комплекса ядерного рецептора экдистероида, демонстрируют дифференциальное распределение молекулярных детерминант, направляющих субклеточный трафик. Cell. Signal. 19, 490–503 (2007).
  38. ^ Фань, М., Ахмед, К. М., Коулман, М. К., Шпиц, Д. Р. и Ли, Дж. Дж. Ядерный фактор каппа-B и супероксиддисмутаза марганца опосредуют адаптивную радиорезистентность в облученных в низких дозах эпителиальных клетках кожи мышей. Cancer Res. 67, 3220–3228 (2007).
  39. ^ Ву, П., Даниэль-Иссакани, С., ЛаМарко, К. и Струловичи, Б. Автоматизированный высокопроизводительный фильтрационный анализ: применение для идентификации ингибиторов полимеразы. Anal. Biochem. 245, 226–230 (1997).
  40. ^ Стоевесандт, О. и Брок, Р. Одношаговый анализ белковых комплексов в микролитрах клеточного лизата с использованием непрямой иммуномаркировки и флуоресцентной кросс-корреляционной спектроскопии. Nat. Protoc. 1, 223–229 (2006).
  41. ^ Бергендаль, В., Гейдук, Т. и Берджесс, Р. Р. Высокопроизводительный скрининговый анализ на основе люминесцентного резонансного переноса энергии для ингибиторов основных белок-белковых взаимодействий в бактериальной РНК-полимеразе. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1492–1498 (2003).
  42. ^ Янг, П. и др. Мультиплексное обнаружение взаимодействия белок-пептид и ингибирования с использованием капиллярного электрофореза. Anal. Chem. 79, 1690–1695 (2007).
  43. ^ Филдс, С. и Сонг, О. Новая генетическая система для обнаружения белок-белковых взаимодействий. Nature 340, 245–246 (1989).
  44. ^ ab Stynen, B; Tournu, H; Tavernier, J; Van Dijck, P (июнь 2012 г.). «Разнообразие генетических методов in vivo для исследований белок-белкового взаимодействия: от дрожжевой двухгибридной системы до млекопитающих с разделением люциферазы». Microbiology and Molecular Biology Reviews . 76 (2): 331–82. doi :10.1128/MMBR.05021-11. PMC 3372256 . PMID  22688816. 
  45. ^ ab Kerppola, TK Визуализация молекулярных взаимодействий с помощью флуоресцентной комплементации. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 449–456 (2006).
  46. ^ Creemers, TM, Lock, AJ, Subramaniam, V., Jovin, TM и Volker, S. Фотофизика и оптическое переключение в мутантах зеленого флуоресцентного белка. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2974–2978 (2000).
  47. ^ Терских, А. и др. «Флуоресцентный таймер»: белок, меняющий цвет со временем. Science 290, 1585–1588 (2000).
  48. ^ van Thor, JJ, Gensch, T., Hellingwerf, KJ & Johnson, LN Фототрансформация зеленого флуоресцентного белка под действием УФ- и видимого света приводит к декарбоксилированию глутамата 222. Nat. Struct. Biol. 9, 37–41 (2002).
  49. ^ Шотерс, Ф; Ван Дейк, П. (2019). «Белко-белковые взаимодействия у Candida albicans». Границы микробиологии . 10 : 1792. doi : 10.3389/fmicb.2019.01792 . ПМК 6693483 . ПМИД  31440220. 
  • Kerppola Lab Online – BiFC
  • Презентация доктора CD Hu – Бимолекулярная флуоресцентная комплементация (BiFC): принципы и применение
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Бимолекулярная_флуоресценция_комплементация&oldid=1106253279"