Транслатомика

Транслатомика — это изучение всех открытых рамок считывания (ОРС), которые активно транслируются в клетке или организме . Эта совокупность ОРС называется транслатомом . Характеристика транслатома клетки может дать представление о массиве биологических путей , которые активны в клетке. Согласно центральной догме молекулярной биологии , ДНК в клетке транскрибируется для получения РНК , которая затем транслируется для получения белка . Тысячи белков закодированы в геноме организма , и белки, присутствующие в клетке, кооперативно выполняют множество функций для поддержания жизни клетки. В различных условиях, таких как во время стресса или определенных временных точек в развитии, клетке могут потребоваться различные биологические пути для активности и, следовательно, разный набор белков. В зависимости от внутренних и внешних условий набор белков, производимых в один момент времени, варьируется. Транслатомные методы могут быть использованы для получения «моментального снимка» этой коллекции активно транслирующихся ОРС, что может дать информацию о том, какие биологические пути активирует клетка в текущих условиях. ^[1]

Обычно для получения информации о транслатоме используется метод профилирования рибосом . ^[2] Недавние достижения, включая профилирование рибосом отдельных клеток, значительно улучшили разрешение этих исследований, позволяя исследователям получить представление о трансляции на уровне отдельных клеток. ^[3] Это особенно важно для гетерогенных популяций клеток, где общие объемные измерения могут маскировать важные различия между клетками в синтезе белка. Другими методами являются профилирование полисом , профилирование транслирующей мРНК полной длины ( RNC-seq ) и очистка аффинности транслирующей рибосомы (TRAP-seq). ^[4] В отличие от транскриптома , транслатом является более точным приближением для оценки уровня экспрессии некоторых генов , поскольку корреляция между протеомом и транслатомом выше, чем корреляция между транскриптомом и протеомом. ^[5]

Ближе к завершению проекта «Геном человека» область генетики сместила свое внимание в сторону определения функций генов. Это включало каталогизацию других коллекций биологических материалов, таких как РНК и белки в клетках. Эти коллекции материалов были названы -омами, вызывая широкое волнение вокруг секвенирования человеческого генома. Термин транслатом был впервые предложен в 2001 году Гринбаумом и др. ^[6] Транслатом был предназначен для описания относительного количества белков в протеоме . Термин транслатом теперь обычно относится к коллекции белков, активно создаваемых в клетке. Транслатомика, в сочетании с деградомикой , направлена ​​на описание чистого изменения протеома при различных условиях.

Целью геномики является изучение генома или набора генетического материала в организме. Подразделы геномики, или другие - омики , такие как транскриптомика и протеомика, направлены на характеристику функции генома путем количественной оценки продуктов генома (таких как РНК и белки) в различных условиях. При этом омики получают представление о различных уровнях регуляции экспрессии генов и, следовательно, функции генома. Однако эти области характеризуют биомолекулы , которые уже были сформированы. В некоторых случаях обилие РНК или белка не отражает функцию, поскольку эти биомолекулы могут быстро деградировать или они могут оставаться в клетке долгое время после того, как они изначально синтезированы. При использовании методов протеомики для изучения протеома регуляция обилия белка на уровне посттрансляционной модификации и деградации белка может скрывать более ранние регуляторные процессы. Поскольку клеточные функции часто регулируются на уровне трансляции, а это означает, что транскриптом не всегда отражает функцию генома ^[1] , использование методов транслатомики для изучения транслатома может позволить наблюдать регуляцию функции генома, которая была бы скрыта в исследованиях транскриптомики или протеомики.

Большинство методов транслатомики сосредоточены на характеристике мРНК, которые связаны с рибосомами и, следовательно, транслируются.

Профилирование полисом — это метод, используемый для характеристики степени трансляции одной или нескольких мРНК. Высокотранслируемая мРНК существует в виде полисомы , то есть она комплексируется с несколькими рибосомами. мРНК, транслируемые на более низких уровнях, комплексуются с меньшим количеством рибосом. При профилировании полисом градиент сахарозы используется для разделения молекулярных комплексов в клеточном лизате на основе размера. ^[7] Фракции из колонки анализируются с помощью секвенирования или других методов. Скорость трансляции мРНК определяется на основе ее обнаружения и распространенности во фракциях с более низкой и более высокой молекулярной массой.

Полноразмерная транслирующая мРНК (RNC-seq) включает центрифугирование лизированного образца на сахарозной подушке. Это позволяет отделить комплекс рибосома-распадающаяся цепь (RNC) от свободных мРНК и других компонентов клетки. RNC образуют осадок при центрифугировании, который собирается для дальнейшего анализа. мРНК, транслируемая в этих RNC, может быть секвенирована, что позволяет идентифицировать и количественно оценить мРНК, транслируемые в это время. ^{[1] [8]} Однако комплексы RNC-мРНК являются хрупкими, что может привести к диссоциации рибосом от мРНК и деградации мРНК, что потенциально искажает собранные результаты. ^[1]

При профилировании рибосом клеточная мРНК, включая полисомы, подвергается воздействию рибонуклеаз, ферментов, которые расщепляют РНК. Те позиции в молекулах РНК, которые связаны рибосомами, защищены от переваривания. После прекращения активности рибонуклеазы эти защищенные участки могут быть восстановлены и секвенированы. Таким образом, последовательности, полученные с помощью рибосека, представляют собой фрагменты мРНК, которые активно транслировались. ^[9]

TRAP-seq используется для идентификации мРНК, активно транслируемых в определенном типе клеток в пределах ткани или другого набора клеток. Тип интересующих клеток конструируется для экспрессии рибосомной субъединицы, слитой с меткой эпитопа, такой как зеленый флуоресцентный белок . ^[10] После лизиса клеток антитела, нацеленные на эпитоп, используются для изоляции мРНК, которые связаны с рибосомами, содержащими белки слияния. Затем эта РНК преобразуется в кДНК и секвенируется. Этот метод специально идентифицирует мРНК, которые транслировались в типе интересующих клеток.

Методы масс-спектрометрии не способны определить сворачивание зарождающихся полипептидов . Ни один из существующих методов не исследует состояние сворачивания зарождающихся полипептидов глобально в клетке. Существуют методы для исследования состояния сворачивания отдельных зарождающихся полипептидов. ^[1]

Один из методов использует неспецифическую протеазу для расщепления зарождающегося пептида при низкой температуре. Протеаза может расщеплять не свернутые, гибкие области, но не может разрезать плотно свернутые области. Продукты расщепления затем можно разделить и изучить, чтобы определить свернутые области зарождающегося пептида. ^{[1] [11]}

Для анализа полной структуры зарождающегося полипептида используется ядерный магнитный резонанс (ЯМР) . ЯМР позволяет динамически просматривать молекулы в растворе и поэтому может использоваться на комплексах рибосома-зарождающаяся цепь (RNC) . Маркировка рибосом позволяет фильтровать данные ЯМР для предполагаемого сигнала рибосомы и идентифицировать сигнал зарождающегося полипептида. ^[12]

В то время как структура новых полипептидов в настоящее время не поддается изучению в глобальном масштабе, их идентификация и количественная оценка — нет.

Один из методов использует вариант маркировки стабильными изотопами аминокислот в клеточной культуре (SILAC). SILAC маркирует белки стабильными изотопами для проведения количественной оценки, сравнивая меченые и немеченые пептиды для количественной оценки. Импульсный SILAC (pSILAC) позволяет маркировать только пептиды, созданные во время импульса. Теоретически это позволяет захватывать только зарождающиеся пептиды для количественной оценки. Однако SILAC требует схожих уровней меченых и немеченых белков для точной количественной оценки. Таким образом, импульсы pSILAC должны длиться намного дольше, чем процесс трансляции, что делает количественную оценку зарождающихся пептидов неточной. ^{[1] [13]}

Био-ортогональное/количественное неканоническое мечение аминокислот (BONCAT/QuaNCAT) использует азидогомоаланин (AHA) для мечения белков. Это позволяет изолировать вновь созданные белки для РС. ^{[14] [15]} Однако использование AHA требует предварительного истощения внутриклеточного метионина и введения AHA, что подвергает клетку стрессу и потенциально изменяет динамику трансляции внутри. Подобно pSILAC, методы AHA требуют более длительных импульсов, что ограничивает их эффективность в количественной оценке зарождающихся пептидов. ^{[1] [13]}

Протеомика цепей, ассоциированных с пуромицином (PUNCH-P), использует метку пуромицин-биотин для захвата растущих полипептидов для РС. Хотя она не нарушает клеточный процесс, она менее чувствительна, чем другие методы обнаружения растущих пептидов. ^{[1] [13]} В дополнение к этим методам количественной оценки разрабатываются и другие методы, основанные на МС.

Деградация мРНК также играет важную роль в регуляции процесса трансляции.

Для изучения механизмов распада, картирования генома неконсервированных и расщепленных транскриптов (GMUCT), параллельного анализа концов РНК (PARE) и секвенирования деградома используют лигазу T4 платформы секвенирования Illumina для секвенирования деконсервированных мРНК. Лигаза T4 лигирует РНК со свободным 5'-монофосфатом. Поскольку зрелые мРНК имеют 5'-концевой кэп, они не связываются как субстраты, оставляя деконсервированные и деградирующие мРНК для связывания. ^[16]

Секвенирование 5′-монофосфорилированных концов (5Pseq) захватывает как кэпированные, так и декэпированные последовательности, что позволяет секвенировать как зрелую мРНК, так и продукты деградации. Это помогает идентифицировать продукты деградации мРНК и используется при изучении остановки рибосомы. ^{[1] [17]}

Эти методы изучают деградацию от 5' до 3', расщепление, опосредованное микроРНК , и распад мРНК, опосредованный бессмысленными молекулами , но не могут измерить деградацию от 3' до 5' и другие механизмы деградации.

Описанные выше методы требуют лизиса клеток и, таким образом, не могут быть реализованы в живых клетках. Метод резонансного переноса энергии флуоресценции одной молекулы (smFRET) и метод отслеживания растущей цепи (NCT) используют флуоресценцию для отслеживания трансляционной активности. Оба метода отслеживают скорости удлинения полипептидов на отдельных мРНК. ^{[18] [19]} Однако ни один из методов не способен обеспечить высокую производительность. ^[1]

Транспортная РНК (тРНК) является важной частью трансляции . ТРНК считывают мРНК, собирая аминокислоты рибосомой в полипептид. Таким образом, распространенность и типы тРНК оказывают большое влияние на скорость синтеза белка. ^[20] ТРНК могут быть очень похожи на другие тРНК, при этом некоторые виды тРНК отличаются только одним нуклеотидом. Это, в сочетании со схожими вторичными и третичными структурами, затрудняет разделение различных видов тРНК. ^[1]

Электрофорез в 2D-геле — классический метод разделения тРНК. Первоначально тРНК денатурируют в 7M мочевине и разделяют в первом измерении геля. 4M мочевина допускает частичную рефолдингу для дополнительного разделения во втором измерении геля. Этот метод позволил разделить на 48 наборов в E. coli и 30 в B. subtilis, но имеет ограниченное разрешение. Большое количество различных видов тРНК не могут быть полностью разделены с помощью электрофореза в 2D-геле, и для 269 тРНК крысы было обнаружено только 62 пятна. ^[21]

Высокоэффективная жидкостная хроматография может быть использована для разделения тРНК на основе аминоацилированных изоакцепторов тРНК. Этот метод не может полностью разделить виды тРНК и не может различать кодоны, хотя он все еще может находить количественные различия между различными клеточными линиями. ^[21]

Масс-спектрометрия (МС) может использоваться для разделения тРНК на основе уникальных продуктов переваривания эндонуклеазой. ^[22] Однако это имеет ограниченное разрешение со смесями из 30 видов тРНК и требует фракционирования перед МС в более крупных группах тРНК. Это также не может использоваться для идентификации видов тРНК deNovo, поскольку требует предварительного знания закономерностей переваривания видов тРНК. ^[21]

Микрочипы на основе гибридизации используют консервативную последовательность 3'CCA в тРНК для присоединения флуоресцентного зонда. Затем для связывания тРНК используются зонды длиной 70-80 нуклеотидов, покрывающие длину тРНК. ТРНК с различиями не менее чем в 8 оснований можно различить с помощью микрочипов, но тРНК с меньшими различиями связываются с тем же зондом. ^[21]

Количественная обратная транскрипция, ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) — еще один способ идентификации и количественной оценки тРНКома. Праймер для консервативной последовательности 3'CCA используется для праймирования обратной транскрипции для всех видов тРНК. Сильная модификация нуклеотидов тРНК и стабильность молекулы тРНК могут быть проблемой, поэтому для противодействия им использовались высокие температуры и деметилирование. Деметилирование также использовалось для противодействия ошибкам, которые вызывает сильное метилирование при секвенировании. ^[1]

Ribo-tRNA-seq был разработан для более близкого наблюдения за ролью тРНК в трансляции. Подобно Ribo-seq, Ribo-tRNA-seq захватывает молекулы тРНК в рибосомах для подготовки библиотеки перед секвенированием ^[23]