Анализ нуклеазы Surveyor

Анализ нуклеазы Surveyor представляет собой ферментативный анализ расщепления несоответствий, используемый для обнаружения несоответствий отдельных оснований или небольших вставок или делеций ( инделей ).

Нуклеаза Surveyor является частью семейства эндонуклеаз , специфичных к несоответствиям , которые были обнаружены в сельдерее (нуклеазы CEL). ^[1] Фермент распознает все замены оснований и вставки/делеции и расщепляет 3'-сторону несоответствующих участков в обеих цепях ДНК с высокой специфичностью ^[2]

Этот анализ использовался для выявления и анализа мутаций в различных организмах и типах клеток, а также для подтверждения модификаций генома после редактирования генома (с использованием CRISPR / TALEN / цинковых пальцев ).

Способность обнаруживать и определять известные и неизвестные мутации имеет большое значение в биомедицинских исследованиях и генетической диагностике (см. Приложения). Поэтому было разработано множество методов, позволяющих проводить научно-исследовательскую и клиническую диагностику таких мутаций.

Самый прямой способ определения изменений/различий в последовательности — это чтение последовательности ДНК с помощью традиционных и высокопроизводительных методов секвенирования ДНК (см. Секвенирование по Сэнгеру и Секвенирование ДНК ). Однако эти методы предоставляют большие объемы ненужных данных и являются дорогостоящими в использовании. ^[3] Кроме того, традиционное секвенирование может быть полезным для обнаружения мутаций зародышевой линии, но может быть менее успешным при обнаружении соматических минорных аллелей с низкой частотой ( мозаицизм ). Поэтому требуются другие подходы, не основанные на секвенировании, для обнаружения мутаций или полиморфизмов.

Другие широко используемые методы зависят от физических свойств ДНК, например, системы, основанные на температуре плавления, такие как анализ одноцепочечного конформационного полиморфизма (SSCP) и денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография (DHPLC). Эти методы, как правило, ограничиваются анализом коротких фрагментов ДНК (< 1000 п.н.) и способны только указать на наличие полиморфизма(ов), но не позволяют легко определить местоположение мутации в последовательности ДНК. Поэтому за этим должны следовать дополнительные методы, чтобы точно определить мутацию или картировать несколько мутаций в одном и том же фрагменте. ^[3]

Анализы ферментативного расщепления несоответствий используют свойства эндонуклеаз, специфичных для несоответствий, для обнаружения и расщепления несоответствий. Эти методы просты в использовании с использованием стандартных лабораторных методов и оборудования и могут обнаруживать полиморфизмы, несоответствия отдельных пар оснований, а также вставки и делеции с низкими частотами. ^[4] Было обнаружено несколько таких ферментов (включая CEL I, эндонуклеазу VII T4, эндонуклеазу V , эндонуклеазу I T7). ^[3]

Одним из часто используемых ферментов является Surveyor nuclease (CEL II), который расщепляет 3'-стороны обеих цепей ДНК с высокой специфичностью в местах замены оснований или вставки/делеции. Этот фермент способен расщеплять множественные мутации в больших фрагментах ДНК и производит обнаруживаемые продукты расщепления из несоответствующей ДНК, представляющей лишь небольшую часть ДНК в популяции, что делает его пригодным для использования в анализах расщепления несоответствия ферментов. ^[2]

В 1998 году Олековски и др. ^[5] идентифицировали новую эндонуклеазу, специфичную для несоответствия. Фермент был очищен из сельдерея и получил название CEL I.

Было показано, что CEL I разрезает ДНК с высокой специфичностью на обеих цепях на 3'-стороне несовпадений с заменой оснований, и поэтому может использоваться в методах обнаружения мутаций ферментов для идентификации мутаций и полиморфизмов. Олековски и коллеги продемонстрировали эту технику, используя этот фермент для обнаружения различных мутаций и полиморфизмов в гене BRCA1 человека. ^{[1] [5] [6]}

При мониторинге очистки CEL I с помощью электрофореза в полиакриламидном геле Янг и др. ^[1] заметили, что были две полосы нуклеазы, которые оставались вместе на всех этапах очистки. Основная активность нуклеазы была обозначена как CEL I, в то время как второстепенная активность на SDS-PAGE была обозначена как CEL II. Они пришли к выводу, что CEL I и CEL II похожи, и что оба способны расщеплять несоответствие ДНК.

В 2004 году Цю и др. разработали технологию обнаружения мутаций на основе CEL II, также известную как Surveyor Nuclease. ^[2] С тех пор этот метод использовался для обнаружения мутаций и полиморфизмов во многих различных организмах и типах клеток (см. приложения).

Нуклеаза Surveyor была лицензирована у онкологического центра Fox Chase компанией Transgenomic, Inc. и впоследствии продана компании IDT , которая в настоящее время занимается ее дистрибуцией.

Первоначально интересующая ДНК (ядерная или митохондриальная ДНК ) извлекается из тканей или клеточной культуры. Это можно сделать стандартными методами экстракции, такими как расщепление протеиназой К с последующим осаждением этанолом или другими коммерчески доступными методами.

Если предполагается, что ДНК будет гетерогенной, например, из пула дифференциально модифицированных клеток или от гетерозиготных носителей мутаций, нет необходимости добавлять контрольную ДНК.

Область интереса как в мутантной, так и в контрольной ДНК дикого типа амплифицируется с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Реакция ПЦР должна проводиться с использованием высокоточной корректирующей полимеразы, чтобы избежать внесения ошибок ПЦР, которые будут интерпретироваться нуклеазой. Реакция ПЦР должна быть оптимизирована для создания одной сильной полосы ПЦР, поскольку неспецифические полосы увеличат фоновый шум анализа.

Если ожидается, что интересующий аллель будет присутствовать с низкой частотой, например, в случае соматического мозаицизма или гетероплазматической митохондриальной ДНК, можно рассмотреть модифицированный протокол ПЦР, который обогащает вариантные аллели из смеси ДНК дикого типа и ДНК, содержащей мутации (например, ХОЛОДНАЯ ПЦР ).

Интересующая ДНК денатурируется и отжигается для образования гетеродуплексов, содержащих несоответствие в точке мутации, которое затем может быть идентифицировано нуклеазой Surveyor. Если ДНК, как прогнозируется, будет гомогенной (например, гомоплазматическая митохондриальная ДНК или идентичные аллели на обеих хромосомах геномной ДНК), то ДНК из контрольного образца необходима для образования гетеродуплекса, который затем распознается нуклеазой. Если образец ДНК гетерогенен, то дополнительная контрольная ДНК не требуется; однако продукты ПЦР все равно должны быть денатурированы и отожжены для создания гетеродуплексов.

Отожженная ДНК обрабатывается нуклеазой Surveyor для расщепления гетеродуплексов. Все типы несовпадений идентифицируются нуклеазой Surveyor, хотя предпочтения по разрезанию несовпадений делятся на четыре группы от наиболее к наименее предпочтительным: CT, AC и CC одинаково предпочтительны по сравнению с TT, за ними следуют AA и GG, и, наконец, наименее предпочтительные AG и GT. Контекст последовательности также влияет на скорость переваривания нуклеазой Surveyor. ^[2]

Продукты расщепленной ДНК можно анализировать с помощью обычного гель-электрофореза или капиллярного электрофореза высокого разрешения. Обнаружение расщепленных продуктов указывает на наличие гетеродуплекса, образованного несоответствием. Местоположение мутации/полиморфизма можно вывести, наблюдая за длиной фрагмента после расщепления. Если флуоресцентно меченые праймеры используются для маркировки 5' и 3' концов продуктов ПЦР, в анализе будут наблюдаться полосы разного цвета. Размер каждой полосы независимо подтверждает положение мутации/полиморфизма. Множественные мутации можно обнаружить по наличию нескольких фрагментов. ^{[1] [5]}

Одним из основных преимуществ обнаружения мутаций и полиморфизмов с использованием методов несоответствия нуклеаз является то, что не требуется никаких предварительных знаний о природе мутации, в отличие от других методов, таких как полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (RFLP), который использовался для анализа SNP в прошлом.

По сравнению с методами, основанными на температуре плавления, методы с использованием эндонуклеаз, специфичных к несоответствиям, не только быстрее, но и позволяют обнаруживать множественные мутации в крупных фрагментах ДНК.

Метод можно использовать в высокопроизводительных системах с использованием автоматизированного впрыска, что делает его пригодным для скрининга. ^[7]

Surveyor nuclease — это достаточно чувствительный фермент, производящий обнаруживаемые продукты расщепления из последовательностей, представляющих лишь небольшую часть ДНК в популяции. Он может обнаруживать соотношение гетеродуплекса к гомодуплексу 1:32 для более мелких продуктов ПЦР (~0,6 кб) и гетеродуплекса к гомодуплексу 1:16 для более длинных продуктов ПЦР (~2,3 кб). Это свойство позволяет объединять клинические образцы с целью увеличения образования гетеродуплекса и, следовательно, чувствительности. ^[3] Это также полезно для обнаружения незначительных вариаций в гетерогенной популяции (например, гетерогенной опухоли). В случае редактирования генома с помощью CRISPR или других методов это свойство может улучшить обнаружение редких событий редактирования в популяции клеток до создания и тестирования отдельных отредактированных клонов.

Нуклеаза Surveyor расщепляет все типы несовпадений, даже если некоторые из них более предпочтительны, чем другие: CT, AC и CC одинаково предпочтительны, чем TT, за ними следуют AA и GG, и, наконец, наименее предпочтительные, AG и GT. Она также обнаруживает индели до как минимум 12 п.н. ^[2]

Анализ нуклеазы Surveyor также может обнаружить множественные мутации в одном и том же фрагменте. Однако для этого требуется несколько дополнительных этапов обработки, которые также могут увеличить фон анализа (см. Ограничения).

Одним из основных ограничений этого анализа является то, что он основан на амплификации ПЦР, и поэтому зависит от качества амплифицированного продукта. Артефакты ПЦР (например, димеры праймеров или укороченные продукты) могут увеличить фоновый шум и скрыть сигнал. Димеры праймеров также могут подавлять активность нуклеазы Surveyor, снижая сигнал.

Поскольку метод ПЦР может вносить собственные мутации во время амплификации, эти ошибки также могут увеличить фоновый шум. Поэтому лучше всего использовать высокоточную полимеразу, чтобы минимизировать ошибки амплификации.

Анализ митохондриальной ДНК может быть подвержен загрязнению последовательностями ядерной митохондриальной ДНК, ко-амплифицированными во время реакции ПЦР, что затрудняет анализ гомоплазматической и гетероплазматической митохондриальной ДНК. ^[8]

Для обнаружения множественных мутаций в одном и том же фрагменте необходимо провести очистку после ПЦР перед расщеплением нуклеазой Surveyor. Обнаружение множественных несовпадений также можно улучшить, увеличив время и количество нуклеазы Surveyor в реакции, но это также увеличит фон из-за неспецифического расщепления.

Нуклеаза Surveyor также обладает 5'-экзонуклеазной активностью, которая атакует концы двухцепочечной ДНК, увеличивая фоновый сигнал во время длительной инкубации. ^[2] Это можно уменьшить, сократив время переваривания и добавив ДНК-полимеразу.

В последние годы появилось несколько технологий редактирования генома, включая нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN), эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции ( TALEN ) и РНК-управляемую нуклеазную систему CRISPR/Cas9 . Эти методы способствуют редактированию генома путем введения двухцепочечного разрыва ДНК с последующей репарацией посредством негомологичного соединения концов (NHEJ) или гомологично-направленной репарации (HDR). В то время как HDR, как ожидается, внесет последовательную модификацию в геном, NHEJ может внести гетерогенную смесь мутаций (обычно небольшие индели), которые будет трудно идентифицировать с помощью секвенирования по Сэнгеру. Точечные мутации и индели могут быть обнаружены с помощью анализа нуклеазы Surveyor, что делает его полезным для обнаружения редактирования генома в пуле клеток без необходимости клонального расширения перед анализом, а также может дать оценку достигнутой эффективности нацеливания. ^{[9] [10] [11]} Даже после клонального расширения обнаружение мутаций с использованием последовательности Сэнгера может быть затруднено, поскольку каждый аллель может подвергаться разному событию редактирования. В этом случае анализ нуклеазы Surveyor фактически будет использовать этот эффект для создания требуемых гетеродуплексов для обнаружения эндонуклеазой несоответствия.

Анализ Surveyor nuclease использовался для обнаружения мутаций зародышевой линии в генах человека. Например, ATRX для умственной отсталости, сцепленной с Х-хромосомой, ^[12] и ген HBB, связанный с β-талассемией. ^[7] Анализ также использовался для обнаружения мутаций митохондриальной и ядерной ДНК, связанных с дефектами дыхательной цепи, ^[13] и мутаций, связанных с заболеванием почек. ^{[14] [15]}

Анализ нуклеазы Surveyor использовался для обнаружения соматических мутаций в различных генах, связанных с раком , и, как указано выше, может использоваться даже в том случае, если образец неоднороден и мутантный аллель составляет всего 1–5 % от общего числа аллелей. ^[16] Метод использовался для обнаружения мутаций в рецепторе эпидермального фактора роста (EGFR), ^{[16] [17] [18] [19]} Янус-киназе 2 (JAK2), ^{[20] [21]} p53 ^[22] и других.

Этот метод использовался для обнаружения мутаций, вызывающих лекарственную устойчивость у Mycobacterium tuberculosis . ^[23]