Обращенно-фазовая хроматография
Хроматографический метод, использующий неполярную неподвижную фазу

Обращенно-фазовая жидкостная хроматография ( RP-LC ) — это режим жидкостной хроматографии , в котором неполярная неподвижная фаза и полярные подвижные фазы используются для разделения органических соединений. [1] [2] [3] Подавляющее большинство разделений и анализов с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в последние годы проводится с использованием обращенно-фазового режима. В обращенно-фазовом режиме компоненты образца удерживаются в системе тем дольше, чем более они гидрофобны . [4]

Факторы, влияющие на удерживание и разделение растворенных веществ в обращенно-фазовой хроматографической системе, следующие:

а) Химическая природа неподвижной фазы , то есть лиганды, связанные на ее поверхности, а также плотность их связей, а именно степень их покрытия.

б) Состав подвижной фазы . Тип основных растворителей, смеси которых влияют на полярность подвижной фазы, отсюда и название модификатор для растворителя, добавляемого для влияния на полярность подвижной фазы.

C. Добавки, такие как буферы, влияют на pH подвижной фазы , которая, в свою очередь, влияет на состояние ионизации растворенных веществ и их полярность.

Для удержания органических компонентов в смесях неподвижные фазы, упакованные в колонки, состоят из гидрофобных субстратов, связанных с поверхностью пористых частиц силикагеля в различных геометриях (сферических, нерегулярных), с различными диаметрами (менее 2, 3, 5, 7, 10 мкм), с различными диаметрами пор (60, 100, 150, 300, A). Поверхность частиц покрыта химически связанными углеводородами , такими как C3, C4, C8, C18 и другими. Чем дольше углеводород связан с неподвижной фазой, тем дольше будут удерживаться компоненты образца. Некоторые неподвижные фазы также изготавливаются из гидрофобных полимерных частиц или гибридизированных частиц кремниевых-органических групп для метода, в котором используются подвижные фазы при экстремальных значениях pH. Большинство современных методов разделения биомедицинских материалов используют колонки C-18, иногда называемые по торговым наименованиям, таким как ODS (октадецилсилан) или RP-18. 

Подвижные фазы представляют собой смеси воды и полярных органических растворителей, подавляющее большинство которых — метанол и ацетонитрил . Эти смеси обычно содержат различные добавки, такие как буферы ( ацетат , фосфат , цитрат ), поверхностно-активные вещества (алкиламины или алкилсульфонаты ) и специальные добавки ( ЭДТА ). Целью использования добавок того или иного вида является повышение эффективности, селективности и контроль удерживания растворенного вещества. 

Стационарные фазы

Идеализированная карикатура силикагеля до и после обработки октадецилтрихлорсиланом (C18H37SiCl3 ) . Большинство силанольных групп ( красные ) преобразуются в гидрофобные алкилсилоксигруппы. [ 5]

История и эволюция обращенно-фазовых неподвижных фаз подробно описаны в статье Мейджорса, Долана, Карра и Снайдера. [6]

В 1970-х годах большинство жидкостных хроматографических циклов выполнялось с использованием твердых частиц в качестве неподвижных фаз, изготовленных из немодифицированного силикагеля или оксида алюминия . Этот тип техники теперь называется нормально-фазовой хроматографией . Поскольку неподвижная фаза в этой технике гидрофильна , а подвижная фаза неполярна (состоит из органических растворителей, таких как гексан и гептан), биомолекулы с гидрофильными свойствами в образце прочно адсорбируются на неподвижной фазе. Более того, они не растворялись легко в растворителях подвижной фазы. В то же время гидрофобные молекулы испытывают меньшее сродство к полярной неподвижной фазе и рано элюируют через нее с недостаточным удерживанием. Это было причиной того, что в 1970-х годах частицы на основе силикагеля обрабатывались углеводородами, иммобилизованными или связанными на их поверхности, а подвижные фазы были переведены на водные и полярные по своей природе, чтобы вместить биомедицинские вещества.

Использование гидрофобной неподвижной фазы и полярных подвижных фаз по сути является обратным процессом нормально-фазовой хроматографии, поскольку полярность подвижной и неподвижной фаз инвертирована – отсюда и термин обращенно-фазовая хроматография. [7] [8] В результате гидрофобные молекулы в полярной подвижной фазе имеют тенденцию адсорбироваться на гидрофобной неподвижной фазе, а гидрофильные молекулы в образце проходят через колонку и элюируются первыми. [7] [9] Гидрофобные молекулы можно элюировать из колонки, уменьшая полярность подвижной фазы с помощью органического (неполярного) растворителя, что снижает гидрофобные взаимодействия. Чем более гидрофобна молекула, тем сильнее она будет связываться с неподвижной фазой и тем выше концентрация органического растворителя, которая потребуется для элюирования молекулы.

Многие математические параметры теории хроматографии и экспериментальные соображения, используемые в других хроматографических методах, применимы и к RP-LC (например, фактор селективности, хроматографическое разрешение, количество тарелок и т. д.). Его можно использовать для разделения самых разных молекул. Обычно его используют для разделения белков [10], поскольку органические растворители, используемые в нормально-фазовой хроматографии, могут денатурировать многие белки.

Сегодня RP-LC является часто используемым аналитическим методом. Существует огромное разнообразие стационарных фаз, доступных для использования в RP-LC, что обеспечивает большую гибкость в разработке методов разделения. [11] [12]

Неподвижные фазы на основе силикагеля

Частицы силикагеля обычно используются в качестве неподвижной фазы в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) по нескольким причинам, [13] [14], включая:

  1. Большая площадь поверхности : частицы силикагеля имеют большую площадь поверхности, что позволяет им напрямую взаимодействовать с растворенными веществами или связывать различные лиганды для разнообразных взаимодействий с молекулами образца, что приводит к лучшему разделению.
  2. Химическая и термическая стабильность и инертность : [15] Силикагель химически стабилен, поскольку он обычно не реагирует ни с растворителями подвижной фазы, ни с разделяемыми соединениями, что обеспечивает точные, повторяемые и надежные анализы.
  3. Широкая применимость : [16] Силикагель универсален и может быть модифицирован различными функциональными группами, что делает его пригодным для широкого спектра аналитов и применений.
  4. Эффективное разделение : уникальные свойства частиц силикагеля в сочетании с их большой площадью поверхности и контролируемым средним диаметром пор частиц [17] способствуют эффективному и точному разделению соединений в ВЭЖХ.
  5. Воспроизводимость : Частицы силикагеля могут обеспечивать высокую воспроизводимость от партии к партии, что имеет решающее значение для единообразных и надежных анализов ВЭЖХ на протяжении десятилетий.
  6. Контроль диаметра частиц и размера пор : [18] [19] Силикагель может быть разработан с определенным размером пор, что позволяет точно контролировать разделение на основе размера молекул.
  7. Экономическая эффективность : кремний является самым распространенным элементом на Земле, поэтому его гель является экономически эффективным выбором для применения в ВЭЖХ, что делает его широко применяемым в лабораториях.

Фармакопея США ( USP) классифицировала колонки для ВЭЖХ по типам L#. [20] Наиболее популярной колонкой в ​​этой классификации является октадецилуглеродная цепь (C18)-связанный силикагель (классификация USP L1). [21] За ним следуют C8-связанный силикагель (L7), чистый силикагель (L3), цианосвязанный силикагель (CN) (L10) и фенилсвязанный силикагель (L11). Обратите внимание, что C18, C8 и фенил являются специализированными обращенно-фазовыми неподвижными фазами, в то время как колонки CN могут использоваться в обращенно-фазовом режиме в зависимости от аналита и условий подвижной фазы. Не все колонки C18 обладают идентичными свойствами удерживания. Поверхностная функционализация силикагеля может быть выполнена в мономерной или полимерной реакции с различными короткоцепочечными органосиланами, используемыми на втором этапе для покрытия оставшихся силанольных групп ( энд-кеппинг ). Хотя общий механизм удерживания остается тем же, тонкие различия в химии поверхности различных неподвижных фаз приведут к изменениям в селективности.

Современные колонки имеют различную полярность в зависимости от лиганда, связанного с неподвижной фазой. PFP — пентафторфенил. CN — циано. NH2 — амино. ODS — октадецил или C18. ODCN — смешанная колонка, состоящая из C18 и нитрила. [22]

Недавние разработки в области хроматографических носителей и приборов для жидкостной хроматографии (ЖХ) способствуют быстрому и высокоэффективному разделению с использованием различных геометрий неподвижных фаз. [23] Были предложены различные аналитические стратегии, такие как использование монолитных носителей на основе кремния, повышенные температуры подвижной фазы и колонки, заполненные поверхностно-пористыми частицами размером менее 3 мкм (сплавленное или твердое ядро) [24] или полностью пористыми частицами размером менее 2 мкм для использования в системах ЖХ сверхвысокого давления (УВЭЖХ). [25]

Подвижные фазы

Подробная статья о современных тенденциях и передовых методах выбора подвижной фазы в обращенно-фазовой хроматографии была опубликована Бойесом и Донгом. [26] Подвижная фаза в обращенно-фазовой хроматографии состоит из смесей воды или водных буферов, к которым добавляются органические растворители для селективного элюирования аналитов из обращенно-фазовой колонки. [7] [27] Добавляемые органические растворители должны смешиваться с водой, и два наиболее распространенных органических растворителя — ацетонитрил и метанол . Также могут использоваться другие растворители, такие как этанол или 2-пропанол ( изопропиловый спирт ) и тетрагидрофуран (ТГФ). Органический растворитель также называется модификатором, поскольку он добавляется к водному раствору в подвижной фазе для изменения полярности подвижной фазы. Вода является наиболее полярным растворителем в обращенно-фазовой подвижной фазе; поэтому снижение полярности подвижной фазы путем добавления модификаторов повышает ее элюирующую силу. Два наиболее широко используемых органических модификатора — ацетонитрил и метанол, хотя ацетонитрил является более популярным выбором. Изопропанол (2-пропанол) также может быть использован из-за его сильных элюирующих свойств, но его использование ограничено его высокой вязкостью, что приводит к более высокому противодавлению. И ацетонитрил, и метанол менее вязкие, чем изопропанол, хотя смесь 50:50 процентов метанола:воды также очень вязкая и вызывает высокое противодавление.

Все три растворителя по существу прозрачны для УФ-излучения. Это важнейшее свойство для обычной обращенно-фазовой хроматографии, поскольку компоненты образца обычно обнаруживаются УФ-детекторами. Ацетонитрил более прозрачен, чем другие, в диапазоне низких длин волн УФ-излучения, поэтому он используется почти исключительно при разделении молекул со слабыми или отсутствующими хромофорами (поглощающими группами УФ-видимого диапазона), такими как пептиды. Большинство пептидов поглощают только на низких длинах волн в ультрафиолетовом спектре (обычно менее 225 нм), а ацетонитрил обеспечивает гораздо более низкое фоновое поглощение на низких длинах волн, чем другие распространенные растворители.

pH подвижной фазы может играть важную роль в удерживании аналита и может изменять селективность некоторых аналитов. [28] [29] Для образцов, содержащих растворенные вещества с ионизированными функциональными группами, такими как амины , карбоксилы , фосфаты , фосфонаты , сульфаты и сульфонаты , ионизацию этих групп можно контролировать с помощью буферов подвижной фазы. [30]

Например, карбоксильные группы в растворенных веществах становятся все более отрицательно заряженными, когда pH подвижной фазы поднимается выше их pKa, следовательно, вся молекула становится более полярной и менее удерживаемой на а-полярной неподвижной фазе. В этом случае повышение pH подвижной фазы выше 4–5 = pH (что является типичным диапазоном pKa для карбоксильных групп) увеличивает их ионизацию, следовательно, уменьшает их удерживание. И наоборот, использование подвижной фазы при pH ниже 4 [31] увеличит их удерживание, поскольку это уменьшит их степень ионизации, сделав их менее полярными.

Те же соображения применимы к веществам, содержащим основные функциональные группы, таким как амины, диапазоны pKa которых составляют около 8 и выше, удерживаются больше, поскольку pH подвижной фазы увеличивается, приближаясь к 8 и выше, поскольку они менее ионизированы, следовательно, менее полярны. Однако в случае подвижных фаз с высоким pH большинство традиционных колонок с обращенной фазой на основе силикагеля, как правило, ограничены для использования с подвижными фазами при pH 8 и выше, поэтому контроль за удерживанием аминов в этом диапазоне ограничен. [32]

Выбор типа буфера является важным фактором при разработке метода ОФ-ЖХ, поскольку он может влиять на удерживание, селективность и разрешение интересующих аналитов. [26] При выборе буфера для ОФ-ВЭЖХ необходимо учитывать ряд факторов, в том числе:

  • Требуемый pH подвижной фазы : буферы наиболее эффективны вблизи своего значения pKa, поэтому важно выбрать буфер с pKa, близким к требуемому pH подвижной фазы.
  • Растворимость буфера в органическом растворителе : буфер должен быть совместим с органическим растворителем, который используется в подвижной фазе, в основном с распространенными органическими растворителями, упомянутыми выше, ацетонитрилом, метанолом и изопропанолом.
  • УФ-отсечение буфера : в случае УФ-детектирования буфер должен иметь УФ-поглощение ниже длины волны детектирования интересующих аналитов. Это предотвратит помехи буфера при детектировании этих аналитов.
  • Совместимость буфера с детектором : если для обнаружения используется масс-спектрометрия (МС), буфер должен быть совместим с прибором масс-спектрометрии (МС). [33] Некоторые буферы, например, содержащие фосфатные соли, нельзя использовать с детекторами МС, поскольку они не являются летучими, как это необходимо, и мешают обнаружению МС, подавляя ионизацию аналитов, делая их необнаруживаемыми МС.

Некоторые из наиболее распространенных буферов, используемых в ОФ-ВЭЖХ, включают: [34]

  • Фосфатные буферы : Фосфатный буфер универсален и может использоваться для достижения широкого диапазона значений pH благодаря 3 значениям pKa. Они также имеют очень низкий УФ-фон для УФ-детектирования. Однако они не подходят для МС-детектирования.
  • Ацетатные буферы : Ацетатные буферы также универсальны и могут использоваться для достижения диапазона значений pH, обычно используемых в RP-LC. С точки зрения УФ-детектирования при длине волны менее 220 нм, это не так благоприятно. Аммоний-ацетатный буфер совместим с MS.
  • Формиатные буферы : Формиатные буферы аналогичны ацетатному буферу с точки зрения диапазона используемых pH и ограниченного УФ-детектирования ниже 225 нм. Его ацетат аммония также совместим с МС.
  • Аммониевые буферы : Аммониевые буферы летучи и часто используются в методах ЖХ-МС. Они также ограничены для обнаружения в слабом УФ-диапазоне.

Заряженные аналиты могут быть разделены на колонке с обращенной фазой с использованием ионного спаривания (также называемого ионным взаимодействием). Этот метод известен как ионно-парная хроматография с обращенной фазой. [35]

Элюирование может осуществляться изократически (состав воды и растворителя не изменяется в процессе разделения) или с использованием градиента раствора (состав воды и растворителя изменяется в процессе разделения, обычно за счет уменьшения полярности).

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ IUPAC , Compendium of Chemical Terminology , 2nd ed. («Золотая книга») (1997). Онлайн-исправленная версия: (2006–) «обращенно-фазовая хроматография». doi :10.1351/goldbook.R05376
  2. ^ Žuvela, Petar; Skoczylas, Magdalena; Jay Liu, J.; Ba̧Czek, Tomasz; Kaliszan, Roman; Wong, Ming Wah; Buszewski, Bogusław; Héberger, K. (2019). «Системы определения характеристик и выбора колонок в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии». Chemical Reviews . 119 (6): 3674–3729. doi :10.1021/acs.chemrev.8b00246. PMID  30604951. S2CID  58631771.
  3. ^ Дорси, Джон Г.; Дилл, Кен А. (1989). «Молекулярный механизм удерживания в обращенно-фазовой жидкостной хроматографии». Chemical Reviews . 89 (2): 331–346. doi :10.1021/cr00092a005.
  4. ^ Ганеш, В.; Пурна Басури, П.; Сахини, К.; Налини, КН (2023). «Поведение удерживания аналитов в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии — обзор». Биомедицинская хроматография . 37 (7): e5482. doi :10.1002/bmc.5482. ISSN  0269-3879. PMID  35962484. S2CID  251540223.
  5. ^ Pape, Peter G. (2017). «Силилирующие агенты». Энциклопедия химической технологии Кирка-Отмера . С. 1–15. doi :10.1002/0471238961.1909122516011605.a01.pub3. ISBN 9780471238966.
  6. ^ Мейджорс, Рональд; Долан, Джон; Карр, Питер; Снайдер, Ллойд (2010). «Новые горизонты в обращенно-фазовой хроматографии». LCGC North America . LCGC North America-06-01-2010. 28 (6): 418–430.
  7. ^ abc Akul Mehta (27 декабря 2012 г.). "Принцип обращенно-фазовой хроматографии HPLC/UPLC (с анимацией)". PharmaXChange . Получено 10 января 2013 г. .
  8. ^ I Molnár и C Horváth (сентябрь 1976 г.). «Обращенно-фазовая хроматография полярных биологических веществ: разделение катехольных соединений с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии». Клиническая химия . 22 (9): 1497–1502. doi : 10.1093/clinchem/22.9.1497 . PMID  8221. Получено 10 января 2013 г.
  9. ^ (Клиническая биохимия, TWHrubey, 54)
  10. ^ Эванс, Дэвид Р. Х.; Ромеро, Джонатан К.; Уэстоби, Мэтью (2009), «Глава 9 Концентрация белков и удаление растворенных веществ», Руководство по очистке белков, 2-е издание, Методы в энзимологии, т. 463, Elsevier, стр. 97–120, doi :10.1016/s0076-6879(09)63009-3, ISBN 978-0-12-374536-1, PMID  19892169 , получено 2022-10-13
  11. ^ Žuvela, Petar; Skoczylas, Magdalena; Jay Liu, J.; Ba̧czek, Tomasz; Kaliszan, Roman; Wong, Ming Wah; Buszewski, Bogusław (2019). «Системы определения характеристик и выбора колонок в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии». Chemical Reviews . 119 (6): 3674–3729. doi :10.1021/acs.chemrev.8b00246. ISSN  0009-2665. PMID  30604951. S2CID  58631771.
  12. ^ Rusli, Handajaya; Putri, Rindia M.; Alni, Anita (2022). "Последние разработки стационарных фаз жидкостной хроматографии для разделения соединений: от белков до небольших органических соединений". Molecules . 27 (3): 907. doi : 10.3390/molecules27030907 . ISSN  1420-3049. PMC 8840574 . PMID  35164170. 
  13. ^ "Преимущества силикагелей для набивки в ВЭЖХ - AGC Chemicals". 2020-11-10 . Получено 2023-10-17 .
  14. ^ Qiu, Hongdeng; Liang, Xiaojing; Sun, Min; Jiang, Shengxiang (2011). «Разработка неподвижных фаз на основе силикагеля для высокоэффективной жидкостной хроматографии». Аналитическая и биоаналитическая химия . 399 (10): 3307–3322. doi :10.1007/s00216-010-4611-x. ISSN  1618-2650. PMID  21221544. S2CID  40721088.
  15. ^ Claessens, HA; van Straten, MA (2004). «Обзор химической и термической стабильности неподвижных фаз для обращенно-фазовой жидкостной хроматографии». Журнал хроматографии A. Стационарная фаза и хроматографическое удерживание: в честь Дж. Дж. Киркланда. 1060 (1): 23–41. doi :10.1016/j.chroma.2004.08.098. ISSN  0021-9673.
  16. ^ Žuvela, Petar; Skoczylas, Magdalena; Jay Liu, J.; Ba̧czek, Tomasz; Kaliszan, Roman; Wong, Ming Wah; Buszewski, Bogusław (2019). «Системы определения характеристик и выбора колонок в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии». Chemical Reviews . 119 (6): 3674–3729. doi :10.1021/acs.chemrev.8b00246. ISSN  0009-2665. PMID  30604951. S2CID  58631771.
  17. ^ Чонг, Вон Джо (2014). «Пористые частицы кремнезема как среда хроматографического разделения: обзор». Бюллетень Корейского химического общества . 35 (12): 3465–3474. doi : 10.5012/bkcs.2014.35.12.3465 . ISSN  0253-2964.
  18. ^ "Колонка ВЭЖХ - Размеры пор и диаметры частиц". www.crawfordscientific.com . Получено 17.10.2023 .
  19. ^ "Размер пор против размера частиц в колонках ВЭЖХ". Chrom Tech, Inc. Получено 17 октября 2023 г.
  20. ^ "Перечень колонок USP L - Колонки HPLC и наливные носители". SMT . Получено 2023-10-17 .
  21. ^ Хроматографические реагенты USP 2007-2008: Используются в USP-NF и Pharmacopeial Forum . Фармакопея США. 2007.
  22. ^ Жувела, Петар; Скоцилас, Магдалена; Джей Лю, Дж.; Ба̧чек, Томаш; Кализан, Роман; Вонг, Мин Ва; Бушевский, Богуслав (2019-03-27). «Системы определения характеристик и выбора колонок в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии». Chemical Reviews . 119 (6): 3674–3729. doi :10.1021/acs.chemrev.8b00246. ISSN  0009-2665. PMID  30604951. S2CID  58631771.
  23. ^ Гийарм, Дэви; Рута, Жозефина; Рудаз, Серж; Вейтей, Жан-Люк (2010). «Новые тенденции в быстрой и высокоразрешающей жидкостной хроматографии: критическое сравнение существующих подходов». Аналитическая и биоаналитическая химия . 397 (3): 1069–1082. doi :10.1007/s00216-009-3305-8. ISSN  1618-2642. PMID  19998028. S2CID  21218108.
  24. ^ Фекете, Сабольч; Ольх, Эржсбет; Фекете, Джен (2012). «Быстрая жидкостная хроматография: доминирование ядра? оболочки и очень мелких частиц». Журнал хроматографии A. 1228 : 57–71. doi : 10.1016/j.chroma.2011.09.050. PMID  21982449.
  25. ^ Фекете, Сабольч; Ганцлер, Каталин; Фекете, Йенё (2011). «Эффективность новой колонки ядро–оболочка (Kinetex™) размером менее 2 мкм на практике, применяемой для разделения малых и больших молекул». Журнал фармацевтического и биомедицинского анализа . 54 (3): 482–490. doi :10.1016/j.jpba.2010.09.021. PMID  20940092.
  26. ^ ab Boyes, Barry; Dong, Michael (2018). «Современные тенденции и передовой опыт в выборе подвижной фазы в обращенно-фазовой хроматографии». LCGC North America . LCGC North America-10-01-2018. 36 (10): 752–768.
  27. ^ Бойес, Барри; Донг, Майкл (2018). «Современные тенденции и передовой опыт в выборе подвижной фазы в обращенно-фазовой хроматографии». LCGC North America . LCGC North America-10-01-2018. 36 (10): 752–768.
  28. ^ Хейрман, Эйми Н.; Генри, Ричард А. (1999). «Важность контроля pH подвижной фазы в обращенно-фазовой ВЭЖХ». Технический бюллетень Keystone .
  29. ^ Schoenmakers, Peter J.; van Molle, Sylvie; Hayes, Carmel MG; Uunk, Louis GM (1991). «Влияние pH на обращенно-фазовую жидкостную хроматографию». Analytica Chimica Acta . 250 : 1–19. Bibcode : 1991AcAC..250....1S. doi : 10.1016/0003-2670(91)85058-Z. ISSN  0003-2670.
  30. ^ Долан, Джон (2017-01-01). «Назад к основам: роль pH в удерживании и селективности». LCGC North America . LCGC North America-01-01-2017. 35 (1): 22–28.
  31. ^ «Как кислый pH влияет на разделение с помощью обращенно-фазовой хроматографии?». www.biotage.com . Получено 18.10.2023 .
  32. ^ Kirkland, JJ; van Straten, MA; Claessens, HA (1995). «Влияние подвижной фазы с высоким pH на высокоэффективные жидкостные хроматографические колонки с обращенной фазой на основе силикагеля». Журнал хроматографии A. 18-й Международный симпозиум по жидкостной хроматографии на колонках, часть I. 691 (1): 3–19. doi :10.1016/0021-9673(94)00631-I. ISSN  0021-9673. S2CID  53646741.
  33. ^ Долан, Джон. «Руководство по выбору буферов для ВЭЖХ и ЖХ-МС» (PDF) .
  34. ^ V. Agrahari; M. Bajpai; S. Nanda (2013). «Основные концепции выбора подвижной фазы для обращенно-фазовой ВЭЖХ». Research J. Pharm. And Tech . 6 (5): 459–464.
  35. ^ Gilar, Martin; Fountain, Kenneth J.; Budman, Yeva; Neue, Uwe D.; Yardley, Kurt R.; Rainville, Paul D.; Russell II, Reb J.; Gebler, John C. (2002). "Анализ олигонуклеотидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ионно-парной обращенной фазой: Прогнозирование удерживания". Journal of Chromatography A. 958 ( 1): 167–182. doi :10.1016/S0021-9673(02)00306-0. ISSN  0021-9673. PMID  12134814.
  • Таблицы, обобщающие различные типы обратных фаз, а также информацию о процессе функционализации
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Обращенно-фазовая_хроматография&oldid=1230333666"