Фотоакустическая микроскопия

Фотоакустическая микроскопия — это метод визуализации, основанный на фотоакустическом эффекте , и является подмножеством фотоакустической томографии . Фотоакустическая микроскопия использует локальное повышение температуры, которое происходит в результате поглощения света в тканях. Используя наносекундный импульсный лазерный луч, ткани подвергаются термоупругому расширению, что приводит к высвобождению широкополосной акустической волны , которая может быть обнаружена с помощью высокочастотного ультразвукового преобразователя. ^[1] Поскольку ультразвуковое рассеяние в тканях слабее оптического рассеяния, фотоакустическая микроскопия способна достигать изображений с высоким разрешением на большей глубине, чем обычные методы микроскопии. Кроме того, фотоакустическая микроскопия особенно полезна в области биомедицинской визуализации из-за ее масштабируемости. Регулируя оптические и акустические фокусы, можно оптимизировать латеральное разрешение для желаемой глубины визуализации. ^[2]

Целью фотоакустической микроскопии является нахождение локального повышения давления , которое можно использовать для расчета коэффициента поглощения по формуле:${\displaystyle p_{0}}$ ${\displaystyle \mu _{a}}$

${\displaystyle p_{0}=\Гамма \eta _{th}\mu _{a}F,}$

где — процент света, преобразованного в тепло, — локальная оптическая плотность потока (Дж/см ² ), а безразмерный параметр Грюнайзена определяется как:${\displaystyle \eta _{th}}$${\displaystyle F}$ ${\displaystyle \Гамма}$

${\displaystyle \Gamma ={\frac {\beta }{\kappa \rho C_{V}}},}$

где - термический коэффициент объемного расширения (К ⁻¹ ), - изотермическая сжимаемость (Па ⁻¹ ), - плотность (кг/м3 ⁾ . ^[3]${\displaystyle \бета}$${\displaystyle \каппа}$${\displaystyle \ро}$

После первоначального повышения давления в среде распространяется фотоакустическая волна со скоростью звука, которую можно обнаружить с помощью ультразвукового датчика.

Одним из основных преимуществ фотоакустической микроскопии является простота реконструкции изображения. Лазерный импульс возбуждает ткань в осевом направлении, а полученные фотоакустические волны обнаруживаются ультразвуковым преобразователем . Затем преобразователь преобразует механическую энергию в сигнал напряжения, который может быть считан аналого-цифровым преобразователем для последующей обработки. Одномерное изображение, известное как A-линия, формируется в результате каждого лазерного импульса. Преобразование Гильберта A-линии выявляет информацию, закодированную по глубине. Затем можно сформировать трехмерное фотоакустическое изображение путем объединения нескольких A-линий, полученных с помощью двухмерного растрового сканирования. ^[3]

Изменение задержек элементов на ультразвуковом преобразователе позволяет фокусировать ультразвуковые волны подобно прохождению через акустическую линзу. Этот метод задержки и суммы позволяет находить сигнал в каждой фокальной точке. Однако боковое разрешение ограничено наличием боковых лепестков , которые появляются под полярными углами и зависят от ширины каждого элемента. ^[4]

В фотоакустических методах визуализации, включая фотоакустическую микроскопию, контраст основан на возбуждении фотона и, таким образом, определяется оптическими свойствами ткани. Когда электрон поглощает фотон, он переходит в более высокое энергетическое состояние. При возвращении на более низкий энергетический уровень электрон подвергается либо радиационной, либо безызлучательной релаксации. Во время радиационной релаксации электрон высвобождает энергию в форме фотона. С другой стороны, электрон, подвергающийся безызлучательной релаксации, высвобождает энергию в виде тепла. Затем тепло вызывает повышение давления, которое распространяется как фотоакустическая волна. В связи с тем, что почти все молекулы способны к безызлучательной релаксации, фотоакустическая микроскопия имеет потенциал для визуализации широкого спектра эндогенных и экзогенных агентов. Напротив, меньшее количество молекул способны к радиационной релаксации, что ограничивает такие методы флуоресцентной микроскопии, как однофотонная и двухфотонная микроскопия . ^[3] Современные исследования в области фотоакустической микроскопии используют как эндогенные, так и экзогенные контрастные вещества для получения функциональной информации об организме: от уровней насыщения крови до скорости распространения рака.

Эндогенные контрастные вещества, молекулы, естественным образом встречающиеся в организме, полезны в фотоакустической микроскопии из-за того, что их можно визуализировать неинвазивно. Эндогенные вещества также нетоксичны и не влияют на свойства изучаемой ткани. В частности, эндогенные поглотители можно классифицировать на основе их поглощающих длин волн. ^[2]

В диапазоне ультрафиолетового света (λ = 180–400 нм) основным поглотителем в организме является ДНК и РНК . Используя ультрафиолетовую фотоакустическую микроскопию, можно визуализировать ДНК и РНК в ядрах клеток без использования флуоресцентной маркировки. Поскольку рак связан с нарушением репликации ДНК , УФ-фотоакустическая микроскопия может быть использована для раннего выявления рака. ^[5]

Видимые поглотители света (λ = 400–700 нм) включают оксигемоглобин , дезоксигемоглобин , меланин и цитохром c . Фотоакустическая микроскопия видимого света особенно полезна для определения концентрации гемоглобина и насыщения кислородом из-за разницы в профилях поглощения оксигемоглобина и дезоксигемоглобина. Затем анализ в реальном времени можно использовать для определения скорости кровотока и скорости метаболизма кислорода. ^[3] Кроме того, фотоакустическая микроскопия способна обнаруживать меланому на ранней стадии из-за высокой концентрации меланина, обнаруженного в клетках рака кожи.

Поглотители ближнего инфракрасного диапазона (λ = 700–1400 нм) включают воду, липиды и глюкозу. Фотоакустическое определение уровня глюкозы в крови может использоваться для лечения диабета, в то время как изучение концентрации липидов в кровеносных сосудах важно для мониторинга прогрессирования атеросклероза . ^[2] Все еще возможно количественно определить и сравнить концентрации дезоксигемоглобина и гемоглобина на этой длине волны, жертвуя более глубоким проникновением в ткани для более низкого поглощения. ^[6]

Хотя эндогенные контрастные агенты неинвазивны и более просты в использовании, они ограничены своим собственным поведением и концентрацией, что затрудняет мониторинг определенных процессов, если оптическое поглощение слабое. С другой стороны, экзогенные агенты могут быть сконструированы для специфического связывания с определенными интересующими молекулами. Кроме того, концентрация экзогенных агентов может быть оптимизирована для получения большего сигнала и обеспечения большего контраста. Благодаря селективному связыванию экзогенные контрастные агенты способны нацеливаться на определенные интересующие молекулы, а также улучшать полученные изображения. ^[3]

Органические красители, такие как ICG -PEG и Evans blue , используются для улучшения сосудистой сети, а также для улучшения визуализации опухолей. Кроме того, красители легко отфильтровываются из организма из-за их малого размера (≤ 3 нм). ^[2]

Наночастицы в настоящее время исследуются из-за их химической неактивности и способности воздействовать на опухолевые клетки. Эти свойства позволяют контролировать распространение рака и потенциально позволяют удалять раковые клетки интраоперационно. Однако необходимы дополнительные исследования краткосрочных токсических эффектов, чтобы определить, подходят ли наночастицы для клинических исследований. ^[2] Золотые наночастицы показали себя многообещающими в качестве контрастного агента для медицины с визуальным контролем. AuNP широко использовались в качестве контрастных агентов из-за их сильного и настраиваемого оптического поглощения. ^[7]

Флуоресцентные белки были разработаны для флуоресцентной микроскопии и являются уникальными в том, что они могут быть генетически закодированы и, следовательно, не требуют доставки в организм. Используя фотоакустическую микроскопию, флуоресцентные белки могут быть визуализированы на глубинах за пределами пределов типичных методов микроскопии. ^[2] Частотно-зависимое акустическое затухание в ткани и затухание более высоких частот ограничивают полосу пропускания света через более глубокие области в ткани. Флуоресцентные белки действуют как источник света в целевой области, обходя ограничение оптического затухания. Однако эффективность флуоресцентных белков ограничена низкими изменениями флюенса , поскольку уравнение диффузии света предсказывает увеличение менее 5%. ^[8]

Фотоакустическая микроскопия достигает большего проникновения, чем обычная микроскопия, благодаря ультразвуковому обнаружению. В результате аксиальное разрешение определяется акустически и определяется по формуле:

${\displaystyle R_{axial}=0,88{\frac {\nu _{A}}{\Delta f_{A}}},}$

где — скорость звука в среде, а — полоса пропускания фотоакустического сигнала. Аксиальное разрешение системы можно улучшить, используя ультразвуковой преобразователь с более широкой полосой пропускания, пока полоса пропускания совпадает с полосой пропускания фотоакустического сигнала. Латеральное разрешение фотоакустической микроскопии зависит от оптических и акустических фокусов системы. Фотоакустическая микроскопия с оптическим разрешением (OR-PAM) использует более узкий оптический фокус, чем акустический фокус, в то время как фотоакустическая микроскопия с акустическим разрешением (AR-PAM) использует более узкий акустический фокус, чем оптический фокус. ^{[9] [10]}${\displaystyle \nu _{A}}$${\displaystyle \Дельта f_{A}}$

Благодаря более узкому оптическому фокусу OR-PAM более полезен для визуализации в квазибаллистическом диапазоне глубин до 1 мм. ^[9] Латеральное разрешение OR-PAM определяется по формуле:

${\displaystyle R_{Lateral,O}=0,51{\frac {\lambda _{O}}{NA_{O}}},}$

где — оптическая длина волны, а — числовая апертура оптического объектива. ^[2] Поперечное разрешение OR-PAM можно улучшить, используя более короткий лазерный импульс и более точную фокусировку лазерного пятна. Системы OR-PAM обычно могут достигать поперечного разрешения от 0,2 до 10 мкм, что позволяет классифицировать OR-PAM как метод получения изображений со сверхвысоким разрешением .${\displaystyle \lambda _{O}}$${\displaystyle NA_{O}}$

На глубинах более 1 мм и до 3 мм фотоакустическая микроскопия с акустическим разрешением (AR-PAM) более полезна из-за большего оптического рассеяния. Акустическое рассеяние намного слабее за пределами оптической диффузии, что делает AR-PAM более практичной, поскольку она обеспечивает более высокое латеральное разрешение на этих глубинах. Латеральное разрешение AR-PAM определяется по формуле:

${\displaystyle R_{lateral,A}=0.71{\frac {\lambda _{A}}{NA_{A}}},}$

где — центральная длина волны фотоакустической волны, а — числовая апертура ультразвукового преобразователя. ^[2] Таким образом, более высокое поперечное разрешение может быть достигнуто за счет увеличения центральной частоты ультразвукового преобразователя и более плотной акустической фокусировки. Системы AR-PAM обычно могут достигать поперечного разрешения от 15 до 50 мкм.${\displaystyle \лямбда _{A}}$${\displaystyle NA_{A}}$

Игнорируя баллистический свет, конфокальная фотоакустическая микроскопия темного поля уменьшает поверхностный сигнал. Этот метод использует импульсный лазер темного поля и ультразвуковое обнаружение с высокой числовой апертурой, при этом выходной конец волокна коаксиально совмещен с сфокусированным ультразвуковым преобразователем. Фильтрация баллистического света основана на измененной форме возбуждающего лазерного луча вместо непрозрачного диска, как это используется в обычной микроскопии темного поля . Общая техника реконструкции используется для преобразования фотоакустического сигнала в одну линию A, а изображения линии B создаются путем растрового сканирования. ^[4]

Фотоакустическая микроскопия имеет широкий спектр применения в области биомедицины. Благодаря своей способности визуализировать различные молекулы на основе оптической длины волны, фотоакустическая микроскопия может использоваться для получения функциональной информации о теле неинвазивным способом. Динамика кровотока и скорость метаболизма кислорода могут быть измерены и сопоставлены с исследованиями атеросклероза или пролиферации опухолей. Экзогенные агенты могут использоваться для связывания с раковой тканью, что повышает контрастность изображения и помогает в хирургическом удалении. В то же время фотоакустическая микроскопия полезна для ранней диагностики рака из-за разницы в оптических поглощающих свойствах по сравнению со здоровой тканью. ^[1]

• Фотоакустическая визуализация
• Глубокое обучение в фотоакустической визуализации