Периодическая противоточная хроматография

Периодическая противоточная хроматография ( PCC ) — это метод проведения аффинной хроматографии квазинепрерывным образом. Сегодня этот процесс в основном используется для очистки антител в биофармацевтической промышленности ^[1], а также в исследованиях и разработках. При очистке антител в качестве аффинной матрицы используется белок А. Однако периодические противоточные процессы могут применяться к любому типу аффинной хроматографии. ^[2]

В обычной аффинной хроматографии одна хроматографическая колонка загружается исходным материалом до точки, когда целевой материал (продукт) больше не может удерживаться аффинным материалом. Затем смола с адсорбированным на ней продуктом промывается для удаления примесей. Наконец, чистый продукт элюируется другим буфером. В частности, если в колонку загружено слишком много исходного материала, продукт может прорваться, и продукт, следовательно, будет потерян. Поэтому очень важно загружать колонку только частично, чтобы максимизировать выход.

Периодическая противоточная хроматография устраняет эту проблему, используя более одной колонки. Процессы PCC можно проводить с любым количеством колонок, начиная с двух. ^[3] В следующем параграфе будет описана версия PCC с двумя колонками, но другие протоколы с большим количеством колонок основаны на тех же принципах (см. ниже). Справа показана схема, изображающая отдельные этапы процесса. На этапе 1, так называемой фазе последовательной загрузки, колонки 1 и 2 соединены между собой. Колонка 1 полностью загружена образцом (красным), в то время как его проскок фиксируется в колонке 2. На этапе 2 колонка 1 промывается, элюируется, очищается и повторно уравновешивается, в то время как загрузка отдельно продолжается в колонке 2. На этапе 3, после регенерации колонки 1, колонки снова соединяются между собой, и колонка 2 полностью загружена, в то время как ее проскок фиксируется в колонке 1. Наконец, на этапе 4 колонка 2 промывается, элюируется, очищается и повторно уравновешивается, в то время как загрузка продолжается независимо в колонке 1. Этот циклический процесс повторяется непрерывно.

Существует несколько вариаций периодической противоточной хроматографии с более чем двумя колонками. В этих случаях дополнительные колонки либо помещаются в поток подачи во время загрузки, что дает тот же эффект, что и использование более длинных колонок. В качестве альтернативы дополнительные колонки могут оставаться в незанятом режиме ожидания во время загрузки. Этот режим обеспечивает дополнительную гарантию того, что основной процесс не зависит от протоколов промывки и очистки, хотя на практике это требуется редко. С другой стороны, недоиспользованные колонки снижают теоретическую максимальную производительность для таких процессов. Как правило, преимущества и недостатки различных многоколоночных протоколов являются предметом дискуссий. ^[4] Однако, без сомнения, по сравнению с пакетными процессами с одной колонкой периодические противоточные процессы обеспечивают значительно более высокую производительность.

В масштабе времени непрерывных хроматографических циклов довольно часто можно наблюдать изменения важных параметров процесса, таких как состояние колонки, качество буфера, титр (концентрация) исходного материала или состав исходного материала. Такие изменения приводят к изменению максимальной емкости колонки относительно количества загруженного исходного материала. Для достижения постоянного качества и выхода для каждого цикла процесса необходимо скорректировать время отдельных этапов процесса. Ручные изменения в принципе возможны, но довольно непрактичны. Чаще всего динамические алгоритмы управления процессом отслеживают параметры процесса и автоматически применяют изменения по мере необходимости.

В настоящее время используются два различных режима работы динамических контроллеров процессов (см. рисунок справа). Первый режим, называемый DeltaUV, отслеживает разницу между двумя сигналами от детекторов, расположенных до и после первой колонки. Во время начальной загрузки существует большая разница между двумя сигналами, но она уменьшается по мере того, как примеси проходят через колонку. Как только колонка полностью насыщена примесями и удерживается только дополнительный продукт, разница между сигналами достигает постоянного значения. Пока продукт полностью улавливается на колонке, разница между сигналами будет оставаться постоянной. Как только часть продукта прорывается через колонку (сравните выше), разница уменьшается. Таким образом, можно определить время и количество прорыва продукта. Вторая возможность, называемая AutomAb, требует только сигнала одного детектора, расположенного за первой колонкой. Во время начальной загрузки сигнал увеличивается по мере того, как все больше и больше примесей проходят через колонку. Когда колонка полностью насыщена примесями и пока продукт полностью улавливается на колонке, сигнал остается постоянным. Как только часть продукта прорывается через колонку (сравните выше), сигнал снова увеличивается. Таким образом, время и количество прорыва продукта снова могут быть определены.

Оба варианта работают одинаково хорошо в теории. На практике необходимость двух синхронизированных сигналов и воздействие неочищенного исходного материала на один детектор делает подход DetaUV менее надежным, чем AutomAb.

По состоянию на 2017 год GE Healthcare владеет патентами на трехколоночную периодическую противоточную хроматографию: эта технология используется в их приборе Äkta PCC. ^{[ требуется ссылка ]} Аналогично, ChromaCon владеет патентами на оптимизированную двухколоночную версию (CaptureSMB). ^{[ требуется ссылка ]} CaptureSMB используется в Contichrom CUBE от ChromaCon и по лицензии в системах Ecoprime Twin от YMC. Дополнительные производители систем, способных выполнять периодическую противоточную хроматографию, включают Novasep и Pall . ^{[ требуется ссылка ]}