pUC19
Вектор клонирования плазмиды
Векторная карта pUC19

pUC19 — один из серии плазмидных векторов клонирования, разработанных Иоахимом Мессингом и его коллегами. [1] Обозначение «pUC» происходит от классического префикса «p» (обозначающего « плазмида ») и сокращения Калифорнийского университета , где проводились ранние работы над серией плазмид. [2] Все плазмиды pUC представляют собой кольцевую двухцепочечную ДНК длиной около 2700 пар оснований. [3] Плазмиды pUC являются одними из наиболее широко используемых векторов клонирования. [3] Это отчасти связано с тем, что клетки, которые были успешно трансформированы, можно легко отличить от тех, которые не были трансформированы, на основе различий в цвете колоний. [3] pUC18 похож на pUC19, но область MCS перевернута.

Функции

pUC19 кодирует N-концевой фрагмент гена β-галактозидазы ( lacZ ) E. coli , также называемый α-пептидом. [4] [3] Сайт множественного клонирования (MCS), содержащий множество сайтов рестрикции , разделен на кодоны 6-7 гена lacZ. [4] Это позволяет проводить сине-белый скрининг при использовании штаммов-хозяев, таких как E. coli JM109, который производит только C-концевую часть lacZ , также известную как β-полипептид. [3] Если pUC19 вставить в E. coli JM109 и выращивать на агаризованной среде, дополненной IPTG и X-gal , то колонии будут синими, так как плазмида кодирует α-пептид, необходимый для создания функциональной формы β-галактозидазы. Однако если фрагмент ДНК вставить в MCS pUC19, колонии будут выглядеть белыми, поскольку плазмида не сможет продуцировать α-пептид. [3]

В дополнение к β-галактозидазе, pUC19 также кодирует ген устойчивости к ампициллину ( amp R ) через фермент β-лактамазу, который функционирует, разрушая ампициллин и снижая его токсичность для хозяина. [5] Клетки, которые были успешно трансформированы с помощью pUC19, можно дифференцировать от клеток, которые не были трансформированы, выращивая их на среде с ампициллином. Выживут только клетки с плазмидой, содержащей amp R.

Начало репликации ( ori ) происходит от плазмиды pMB1. [6] [1] pUC19 — это плазмида с большим числом копий . [3] Большое число копий является результатом отсутствия гена rop и единственной точечной мутации в ori pMB1. [7] [8]

Механизм

Схематическое изображение молекулярного механизма, используемого для скрининга рекомбинантных клеток.

Фрагмент lacZ , синтез которого может быть индуцирован IPTG, способен к внутриаллельной комплементации с дефектной формой фермента β-галактозидазы, кодируемой хромосомой хозяина (мутация lacZDM15 в штаммах E. coli JM109, DH5α и XL1-Blue). [4] В присутствии IPTG в питательной среде бактерии синтезируют оба фрагмента фермента. Оба фрагмента могут вместе гидролизовать X-gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозид) и образовывать синие колонии при выращивании на средах, где он добавлен.

Вставка чужеродной ДНК в MCS, расположенный внутри lacZ, вызывает инсерционную инактивацию этого гена на N-концевом фрагменте бета-галактозидазы и отменяет внутриаллельную комплементацию. Таким образом, бактерии, несущие рекомбинантные плазмиды в MCS, не могут гидролизовать X-gal, что приводит к образованию белых колоний, которые можно отличить на культуральной среде от нерекомбинантных клеток, которые имеют синий цвет. [9]

Использование в исследованиях

Благодаря широкому использованию в качестве вектора клонирования в исследованиях и промышленности, pUC19 часто используется в исследованиях в качестве модельной плазмиды. [10] Например, биофизические исследования его естественного сверхспирального состояния определили, что его радиус инерции составляет 65,6 нм, а его радиус Стокса — 43,6 нм.

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ ab Яниш-Перрон, Селеста; Виейра, Джеффри; Мессинг, Иоахим (1985). «Улучшенные векторы клонирования фага M13 и штаммы-хозяева: нуклеотидные последовательности векторов M13mp18 и pUC19». Gene . 33 (1): 103– 119. doi :10.1016/0378-1119(85)90120-9. PMID  2985470.
  2. ^ Виейра, Джеффри; Мессинг, Иоахим (1982). «Плазмиды pUC, система, полученная из M13mp7, для инсерционного мутагенеза и секвенирования с синтетическими универсальными праймерами». Gene . 19 (3): 259– 268. doi :10.1016/0378-1119(82)90015-4. PMID  6295879.
  3. ^ abcdefg Хенкин, Тина М .; Питерс, Джозеф Э. (2020). «Плазмиды». Молекулярная генетика бактерий Снайдера и Чампнесса (Пятое изд.). Хобокен, Нью-Джерси: John Wiley & Sons, Inc., стр.  208–209 . ISBN 9781555819750.
  4. ^ abc Louro, Ricardo O.; Crichton, Robert R. (2013). Практические подходы к биологической неорганической химии. Амстердам, Оксфорд: Elsevier . стр. 279. ISBN 9780444563590. Получено 7 апреля 2014 г.
  5. ^ Ван, Нам Сан. «Обзор сайтов по pUC19». Кафедра химической и биомолекулярной инженерии Мэрилендского университета . Получено 27 января 2017 г.
  6. ^ Хелински, Дональд Р. (15 декабря 2022 г.). «Краткая история плазмид». EcoSal Plus . 10 (1): eESP -0028-2021. doi :10.1128/ecosalplus.esp-0028-2021. PMC 10729939. PMID  35373578. 
  7. ^ О'Хэнлон Корт, Карен (26 ноября 2014 г.). «pUC18 – Вероятно, лучшая высококопийная плазмида в мире!». BiteSize Bio .
  8. ^ Saha, Arjun; Haralalka, Shruti; Bhadra, Rupak K. (ноябрь 2004 г.). «Естественно возникающая точечная мутация в 13-мерном повторе R влияет на функцию oriC большой хромосомы Vibrio cholerae O1 классического биотипа». Архивы микробиологии . 182 (5): 421– 427. Bibcode : 2004ArMic.182..421S. doi : 10.1007/s00203-004-0708-y. PMID  15375645. S2CID  28286917.
  9. ^ Пастернак, Джек Дж. (2005). Введение в молекулярную генетику человека (2-е изд.). Wiley . стр. 117. ISBN 978-0-471-71917-5.
  10. ^ Störkle, Dominic (5 сентября 2007 г.). «Образование комплекса ДНК с противоположно заряженными полиэлектролитами с различной топологией цепи: цилиндрические щетки и дендримеры». Macromolecules . 40 (22): 7998– 8006. Bibcode :2007MaMol..40.7998S. doi :10.1021/ma0711689.
  • Последовательность pUC19
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=PUC19&oldid=1260870269"