Секвенирование Максама-Гилберта
Секвенирование Максама-Гилберта — метод секвенирования ДНК, разработанный Алланом Максамом и Уолтером Гилбертом в 1976–1977 годах. Этот метод основан на частичной химической модификации ДНК, специфичной для нуклеиновых оснований , и последующем расщеплении остова ДНК на участках, прилегающих к модифицированным нуклеотидам . [1]
Секвенирование Максама-Гилберта было первым широко принятым методом секвенирования ДНК и, наряду с дидезокси-методом Сэнгера , представляет собой первое поколение методов секвенирования ДНК. Секвенирование Максама-Гилберта больше не используется широко, будучи вытесненным методами секвенирования следующего поколения .
История
Хотя Максам и Гилберт опубликовали свой метод химического секвенирования через два года после того, как Фредерик Сэнгер и Алан Коулсон опубликовали свою работу по плюс-минус секвенированию, [2] [3] секвенирование Максама–Гилберта быстро стало более популярным, поскольку очищенную ДНК можно было использовать напрямую, в то время как первоначальный метод Сэнгера требовал, чтобы каждое начало чтения было клонировано для производства одноцепочечной ДНК. Однако с улучшением метода обрыва цепи (см. ниже) секвенирование Максама–Гилберта вышло из моды из-за своей технической сложности, запрещающей его использование в стандартных наборах для молекулярной биологии, широкого использования опасных химикатов и трудностей с масштабированием. [4]
Статья Аллана Максама и Уолтера Гилберта 1977 года «Новый метод секвенирования ДНК» была удостоена награды Citation for Chemical Breakthrough Award от Отделения истории химии Американского химического общества за 2017 год. Она была представлена на кафедру молекулярной и клеточной биологии Гарвардского университета. [5]
Процедура
Секвенирование Максама-Гилберта требует радиоактивной маркировки на одном 5'-конце фрагмента ДНК, который необходимо секвенировать (обычно с помощью реакции киназы с использованием гамма- 32 P ATP ) и очистки ДНК. Химическая обработка приводит к разрывам в небольшой пропорции одного или двух из четырех нуклеотидных оснований в каждой из четырех реакций (G, A+G, C, C+T). Например, пурины ( A+G) депуринируются с использованием муравьиной кислоты , гуанины (и в некоторой степени аденины ) метилируются диметилсульфатом , а пиримидины (C+T) гидролизуются с использованием гидразина . Добавление соли ( хлорида натрия ) к реакции гидразина ингибирует реакцию тимина для реакции C-only. Затем модифицированные ДНК можно расщепить горячим пиперидином ; (CH2 ) 5NH в положении модифицированного основания. Концентрация модифицирующих химикатов контролируется для введения в среднем одной модификации на молекулу ДНК. Таким образом, генерируется серия меченых фрагментов, от радиоактивно меченого конца до первого «разрезанного» сайта в каждой молекуле.
Фрагменты в четырех реакциях электрофорезируются бок о бок в денатурирующих акриламидных гелях для разделения по размеру. Для визуализации фрагментов гель экспонируется на рентгеновской пленке для авторадиографии , что дает серию темных полос, каждая из которых показывает местоположение идентичных радиоактивно меченых молекул ДНК. Из наличия и отсутствия определенных фрагментов можно сделать вывод о последовательности. [1] [6]
Связанные методы
Этот метод привел к созданию анализа интерференции метилирования, который используется для картирования участков связывания ДНК с ДНК-связывающими белками . [7]
В 1994 году был разработан автоматизированный протокол секвенирования Максама-Гилберта. [8]
Смотрите также
Ссылки
- ^ ab Maxam AM, Gilbert W (февраль 1977). "Новый метод секвенирования ДНК". Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 74 (2): 560–4. Bibcode :1977PNAS...74..560M. doi : 10.1073/pnas.74.2.560 . PMC 392330 . PMID 265521.
- ^ Sanger F, Coulson AR (май 1975). "Быстрый метод определения последовательностей в ДНК с помощью синтеза с использованием ДНК-полимеразы". J. Mol. Biol . 94 (3): 441–8. doi :10.1016/0022-2836(75)90213-2. PMID 1100841.
- ^ Сэнгер Ф. Определение последовательностей нуклеотидов в ДНК. Нобелевская лекция, 8 декабря 1980 г.
- ^ Грациано Песоле; Сесилия Сакконе (2003). Справочник по сравнительной геномике: принципы и методология. Нью-Йорк: Wiley-Liss. С. 133. ISBN 0-471-39128-X.
{{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ "Ссылки на лауреатов премии Chemical Breakthrough Awards 2017". Отдел истории химии . Получено 12 марта 2018 г.
- ^ «Протоколы Колд Спринг Харбор — Химическое секвенирование».
- ^ «Протоколы Колд Спринг Харбор — Анализ интерференции метилирования».
- ^ Боланд, Э.Дж.; Пиллаи, А; Одом, МВт; Джагадисваран, П. (июнь 1994 г.). «Автоматизация реакций химического секвенирования Максама-Гилберта». БиоТехники . 16 (6): 1088–92, 1094–5. ПМИД 8074875.
