MAGIChip

MAGIChips , также известные как « микрочипы гель-иммобилизованных соединений на чипе » или « трехмерные ДНК-микрочипы », представляют собой устройства для молекулярной гибридизации, полученные путем иммобилизации олигонуклеотидов , ДНК , ферментов , антител и других соединений на фотополимеризованной микроматрице из полиакриламидных гелевых подушек размером 100x100x20 мкм или меньше. Эта технология используется для анализа гибридизации нуклеиновых кислот , специфического связывания ДНК и низкомолекулярных соединений с белками и белок-белковых взаимодействий.

Гелевые подушечки увеличивают поверхность для гибридизации в 50 раз по сравнению с типичными микрочипами, которые печатаются на плоской поверхности предметного стекла, обычно обработанного химическими соединениями, к которым прилипают зонды. Плотность зонда более 1012 молекул на гелевую подушечку может быть достигнута благодаря трехмерной природе гелевых подушечек. Массив основан на стеклянной поверхности, к которой прикреплены небольшие блоки полиакриламидного геля. Каждый блок геля функционирует как отдельная реакционная ячейка, поскольку он окружен гидрофобной стеклянной поверхностью, которая предотвращает смешивание раствора в блоках геля. Это закладывает основу для выполнения лигирования , удлинения одного основания, ПЦР-амплификации ДНК, масс-спектрометрии MALDI-TOF на чипе и других реакций.

Рисунок 1. Слайд MAGIChip, демонстрирующий трехмерную природу зондов в гелевых подушечках.

Историческая справка

Технология MAGIChip была разработана в результате сотрудничества доктора Дэвида Шталя из Вашингтонского университета и доктора Андрея Мирзабекова, бывшего сотрудника Аргоннской национальной лаборатории. Андрей Мирзабеков инициировал разработку секвенирования ДНК путем гибридизации с олигонуклеотидами: новый метод в 1988 году. Этот метод стал основой для биотехнологии, которая использует биологические микрочипы для быстрой идентификации структур ДНК, что имеет большое значение в борьбе с различными заболеваниями.

В 1998 году Motorola Inc, Packard Instrument Company и Аргоннская национальная лаборатория Министерства энергетики США объявили о совместном исследовательском проекте. В 1999 году исследователи Аргоннской национальной лаборатории продвинули разработку технологии биочипов типа микроматрицы, которую они совместно разработали с Институтом Энгельгардта, чтобы предотвратить всемирную вспышку туберкулеза.

Motorola разработала производственные процессы для массового производства биочипов, а Packard разработала и изготовила аналитические приборы для обработки и анализа биочипов. Вклад Аргонна, совместно с Институтом молекулярной биологии Энгельгардта (EIMB) , представлял собой интеллектуальную собственность в виде 19 изобретений, связанных с биологическими микрочипами.

Однако это сотрудничество между EIMB в Москве и Аргоннской национальной лабораторией в Иллинойсе и двумя другими коммерческими партнерами из США прекратилось в результате спора по поводу договорных отношений между сторонами в 2001 году. В результате этого спора доктор Андрей Мирзабеков ушел с поста директора Аргоннского центра биочиповых технологий. ^{[ необходима цитата ]}

Метод

Массивы гелевых элементов (прокладок) создаются на стеклянной поверхности (микроматрице), после чего следует нанесение и химическая иммобилизация различных соединений (зондов) на эти гелевые прокладки. Затем в эту микроматрицу, содержащую иммобилизованные зонды в гелевых прокладках, добавляется тестовый образец, и реакции молекулярного распознавания происходят при определенных условиях. Тестовый образец помечается флуоресцентной меткой для мониторинга молекулярных взаимодействий. Анализ моделей молекулярных взаимодействий выполняется с помощью специализированного программного обеспечения.

Массив гелевых элементов на предметном стекле подготавливается методом '''фотополимеризации'''. Раствор акриламида, который должен быть полимеризован, наносится в полимеризационную камеру. Полимеризационная камера состоит из кварцевой маски, двух тефлоновых прокладок и микроскопического предметного стекла, скрепленных двумя металлическими зажимами. Внутренняя сторона кварцевой маски имеет ультрафиолетовые (УФ)-прозрачные окна, расположенные определенным пространственным образом в непрозрачной хромовой пленке. Собранная камера, содержащая акриламидный гель, подвергается воздействию УФ-излучения, чтобы обеспечить полимеризацию только в тех положениях камеры, которые расположены непосредственно под прозрачными окнами.

Олигонуклеотиды или фрагменты ДНК должны быть активированы, чтобы содержать химически активные группы для облегчения связывания с активированными элементами геля. Активация зонда зависит от химии активации полиакриламидных гелей. Таким образом, для иммобилизации в альдегидсодержащем геле зонд должен иметь реактивную аминогруппу, а если гели активируются введением аминогрупп, зонды должны содержать свободную альдегидную группу. Зонды обычно готовятся путем введения химически активных групп в терминальное положение олигонуклеотидов во время их синтеза.

Зонды для иммобилизации переносятся в гелевые элементы микроматрицы с помощью дозирующих роботов. Волоконно-оптический штифт роботов имеет гидрофобную боковую поверхность и гидрофильный наконечник и работает при температуре росы, чтобы предотвратить испарение образца во время переноса. Активированные зонды химически иммобилизуются путем связывания олигонуклеотидов, несущих амино- или альдегидные группы, с гелевыми носителями, содержащими альдегидные или аминогруппы соответственно.

Целевые молекулы маркируются флуоресцентными красителями . Флуоресцентное обнаружение позволяет контролировать процесс в реальном времени с высоким пространственным разрешением. Критерии процедуры маркировки включают в себя –

Это должно быть просто, быстро и недорого.
Он должен быть применим как к РНК-, так и к ДНК-мишеням.
Он должен быть совместим с фрагментацией, необходимой для уменьшения образования вторичной структуры.
Он должен позволять включать одну метку в один фрагмент, чтобы обеспечить надлежащую количественную оценку интенсивности гибридизации.
Он должен позволять связывать несколько красителей.

Реакции амплификации на чипе

Амплификация реакции гибридизации на чипе служит очень полезным инструментом, когда исследуемая ДНК или белок присутствуют в относительно небольшой пропорции в молекулярной популяции, нанесенной на чип, например, когда мы имеем дело с единичной копией гена или мРНК с низкой распространенностью.

В методе удлинения одной базы ^[1] праймер гибридизуется с ДНК и удлиняется дидезоксирибонуклеозидтрифосфатом, который соответствует нуклеотиду в полиморфном сайте. Проведение этой реакции при температуре выше температуры плавления дуплекса между ДНК и иммобилизованным зондом позволяет быстро ассоциировать/диссоциировать целевую ДНК. Таким образом, одна и та же молекула ДНК реагирует со многими индивидуальными праймерами, что приводит к амплификации праймеров в каждой индивидуальной гелевой подушечке. Эта процедура была применена для идентификации мутации гена бета-глобина у пациентов с бета-талассемией и для обнаружения гена токсина сибирской язвы.

Рисунок 4. Реакция удлинения одного нуклеотида

Чипы также представляют собой хорошую платформу для проведения ПЦР непосредственно на чипе (в отдельных гелевых подушечках), поскольку каждую гелевую подушечку легко изолировать от соседней, в отличие от типичных микрочипов, которые сталкиваются с серьезными проблемами при выполнении той же задачи.

Для анализа результатов гибридизации, полученных с флуоресцентно мечеными целевыми молекулами, используются флуоресцентные микроскопы . Прибор оснащен столом для образцов с контролируемой температурой для изменения температуры в реакционной камере, содержащей чип, в ходе эксперимента. Охлаждаемая камера с зарядовой связью (CCD) используется для записи световых сигналов с чипа, которые затем отправляются в компьютерную программу для количественной оценки сигналов гибридизации по всему чипу. Данные, полученные в ходе этих экспериментов, хранятся в базе данных и анализируются программным обеспечением, которое помогает обеспечить оценку, эксперименты in silico и контроль качества оборудования и программного обеспечения.

Типы

олигонуклеотидные чипы

Индивидуально разработанные олигонуклеотидные биочипы предназначены для опроса тестовых образцов известных нуклеотидных последовательностей. Например, известных генов в случаях, когда интересуют уровни их экспрессии при определенных условиях, генов, которые, как известно, содержат точечные мутации или являются полиморфными в данной популяции. Успех микрочипа зависит от правильного выбора зондов в этих случаях.

Для каждой последовательности ДНК создается набор потенциальных зондов гибридизации, которые образуют идеальные дуплексы с этой последовательностью. Потенциальные зонды, которые могут создавать неоднозначности в интерпретации паттерна гибридизации, исключаются на основе содержания AT против GC и склонности к образованию шпилек и других типов стабильных вторичных структур, которые могут существенно влиять на интенсивность гибридизации.

Одним из случаев успешного применения индивидуальных олигонуклеотидных чипов является обнаружение мутации бета-талассемии у пациентов. Для диагностики мутаций бета-талассемии был разработан простой чип, содержащий шесть зондов, соответствующих различным генотипам бета-талассемии , и гибридизированный с ПЦР-амплифицированной ДНК здоровых людей и пациентов. ^[2] Результаты гибридизации показали ожидаемые существенные различия в интенсивности сигнала между совпадающими и несовпадающими дуплексами, что позволило надежно идентифицировать как гомозиготные, так и гетерозиготные мутации.

чипы рРНК

Эти чипы были разработаны для мишеней рибосомальной РНК (рРНК), обычно используемых для обнаружения бактерий. рРНК очень распространены в клетке, составляя около 80% содержания РНК типичной эукариотической клетки. ^[3] рРНК предварительно амплифицируется бактериями, и присутствует в нескольких тысячах копий на клетку, что делает ее хорошей мишенью для микроанализов. Однонуклеотидные полиморфизмы, присутствующие в бактериальной рРНК-последовательности, используются для дифференциации бактерий на уровне рода, вида и штамма. Это уникальная особенность этого микрочипа, которая не требует амплификации на основе ПЦР. Процесс обнаружения бактерий относительно прост. Бактерии культивируются, промываются и осаждаются. Лизосома используется для лизиса осадка - для разрушения клеточных стенок и высвобождения нуклеиновой кислоты. Лизированные бактерии проходят через цветную ^{[ проверьте написание ]} подготовку, где нуклеиновая кислота из клетки иммобилизуется, а другой мусор вымывается. Все процессы после лизиса - выделение, очистка, фрагментация и маркировка целевых рРНК - являются стабильными химическими реакциями. Фрагменты <500 п.н. легко гибридизуются с гелевой матрицей. Общее количество элюированных с чипа определяется с помощью УФ-спектрофотометра. Процесс от подготовки образца до идентификации организмов на основе автоматизированных алгоритмов занимает 2 часа.

кДНК

cDNA, полученные путем обратной транскрипции популяции мРНК, извлеченной из клеток в различных физиологических и экспериментальных условиях, используются в качестве иммобилизованных зондов. Эти массивы широко используются для изучения экспрессии генов. Потенциальное препятствие в использовании cDNA связано со сложностью инъекции и равномерного распределения длинных молекул в гелевые подушечки. Эта проблема решается путем разработки полиакриламидных гелей, которые содержат больший средний размер пор. Другой способ решения этой проблемы — случайная фрагментация cDNA на относительно небольшие части перед иммобилизацией.

Белки

Можно приготовить белковые чипы, которые содержат различные белки, иммобилизованные в качестве зондов таким образом, чтобы сохранить их биологическую активность. ^[4] Для предотвращения диффузии белка в гель используется крупнопористый гель. Существует два способа иммобилизации белков на гелевых подушках. Первый основан на активации геля глутиральдегидом. Во второй процедуре гель активируется путем частичной замены аминогрупп гидразидными группами . Реакция между гидразидными и альдегидными группами эффективно сшивает белок с клеткой. Белковые микрочипы демонстрируют высокую специфичность в реакциях молекулярного распознавания, как это видно в растворе. Взаимодействие между антигеном и его специфическими антителами можно изучать на чипе в различных экспериментальных условиях. Либо антиген , либо антитело можно иммобилизовать и контролировать как прямыми, так и косвенными методами. В прямом методе используются целевые молекулы, меченые флуоресцентным красителем, а в косвенном методе реакция обнаруживается с помощью меченой молекулы, которая специфически распознает цель. Эти чипы могут быть использованы для изучения ферментативной активности иммобилизованных ферментов путем покрытия чипа раствором, содержащим определенные субстраты. Реакция контролируется путем обнаружения образования окрашенных или флуоресцентных осадков.

Другие приложения

Их можно использовать для изучения однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в его методе. Поскольку бактериальная ДНК высококонсервативна с течением времени, SNP полезны для идентификации бактерий на чипе, и поскольку SNP являются наиболее распространенными вариациями в геноме человека, они стали основными маркерами для генетических исследований для картирования и идентификации восприимчивых генов для сложных заболеваний. ^[5]
Их можно использовать для обнаружения факторов вирулентности, которые являются токсинами и белками, которые проникают в организм. Эти токсины, как правило, имеют небольшое количество копий транскриптов и производятся в очень специфических условиях, обнаруженных у хозяина. Здесь стратегия идентификации фокусируется на последовательности ДНК с одной копией, где MAGIChips очень эффективны.
Белковые биочипы делают его очень захватывающим, поскольку белки содержатся в одной клетке, и все они могут быть проанализированы на одной платформе массива. Белковые биочипы могут быть использованы для идентификации белковых биомаркеров для диагностики заболеваний или определенной стадии заболевания. Они также могут помочь очертить связь между структурой белка и функцией белка и определить функцию белка или различных белков в тех же или разных типах клеток. Хотя MAGIChips нуждаются в некоторых модификациях, приложения и методы вполне стандартны. ^[6]
Чипы могут использоваться в качестве диагностического инструмента в клиниках благодаря быстрому времени обнаружения, высокой пропускной способности, достоверности результатов, иерархической идентификации и количественной оценке. С ними можно достичь времени, необходимого для сбора образцов, для сообщения результатов в клинических условиях в течение 2 часов. Быстрое время выполнения является привлекательным атрибутом тестирования в месте оказания помощи, пока пациент ждет результатов.
Высокая пропускная способность этих устройств позволяет использовать тысячи микробных зондов для идентификации видов и даже штаммов одновременно на одном чипе, что сокращает количество образца, необходимого для проведения нескольких тестов. Потенциальные угрозы, создаваемые использованием бактерий, вирусов и грибков в качестве биологического оружия против людей, сельского хозяйства и окружающей среды, требуют разработки технологии для точного и чувствительного обнаружения в течение очень короткого времени. Перспективная технология MAGIChip, которая использовалась для дискриминации важных вирусов. Грибковые зонды были введены в чипы рРНК для сельскохозяйственных исследований в области генетики, воспроизводства, болезней и даже защиты урожая. Тысячи генов могут быть одновременно нацелены на поиск генетического разнообразия или микробного заражения по природе или путем преднамеренного высвобождения.

Смотрите также

Ссылки

^ (1998)Вторые места. Science 282, 2156–2157.
^ Ершов, Г., Барский, В., Бельговский, А., Кириллов, Е., Крейндлин, Е., Иванов, И., Паринов, С., Гущин, Д., Дробышев, А., Дубилей, С. и Мирзабеков, А. (1996) Анализ и диагностика ДНК на олигонуклеотидных микрочипах. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4913–4918.
^ Златанова, Дж. и Мирзабеков, А., «Гель-иммобилизованные микрочипы нуклеиновых кислот и белков. Производство и применение для макромолекулярных исследований», Методы мол. биологии 170, 17−38 (2001).
^ Гущин, Д., Ершов, Г., Заславский, А., Джеммелл, А., Шик, В., Прудников, Д., Аренков, П. и Мирзабеков, А. (1997) Ручное изготовление олигонуклеотидных, ДНК и белковых микрочипов. Anal. Biochem. 250, 203–211.
^ Вайнер, М. П. и Хадсон, Т. Дж., «Введение в однонуклеотидные полиморфизмы: открытие маркеров заболеваний», Biotechniques 32(S), 4−13 (2002).
^ Организация биотехнологической промышленности (Bio), Технологии и их применение, доступно по адресу http://www.bio.org/er/applications.asp.

[1] (1998)Вторые места. Science 282, 2156–2157.

[2] Ершов, Г., Барский, В., Бельговский, А., Кириллов, Е., Крейндлин, Е., Иванов, И., Паринов, С., Гущин, Д., Дробышев, А., Дубилей, С. и Мирзабеков, А. (1996) Анализ и диагностика ДНК на олигонуклеотидных микрочипах. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4913–4918.

[3] Златанова, Дж. и Мирзабеков, А., «Гель-иммобилизованные микрочипы нуклеиновых кислот и белков. Производство и применение для макромолекулярных исследований», Методы мол. биологии 170, 17−38 (2001).

[4] Гущин, Д., Ершов, Г., Заславский, А., Джеммелл, А., Шик, В., Прудников, Д., Аренков, П. и Мирзабеков, А. (1997) Ручное изготовление олигонуклеотидных, ДНК и белковых микрочипов. Anal. Biochem. 250, 203–211.

[5] Вайнер, М. П. и Хадсон, Т. Дж., «Введение в однонуклеотидные полиморфизмы: открытие маркеров заболеваний», Biotechniques 32(S), 4−13 (2002).

[6] Организация биотехнологической промышленности (Bio), Технологии и их применение, доступно по адресу http://www.bio.org/er/applications.asp.