Линейный дихроизм

Линейный дихроизм ( LD ) или диаттенюация — это разница между поглощением света, поляризованного параллельно и поляризованного перпендикулярно оси ориентации. ^[1] Это свойство материала, пропускание которого зависит от ориентации линейно поляризованного света, падающего на него. Как метод, он в основном используется для изучения функциональности и структуры молекул . Измерения LD основаны на взаимодействии между веществом и светом и, таким образом, являются формой электромагнитной спектроскопии .

Этот эффект был применен по всему спектру ЭМ , где различные длины волн света могут зондировать множество химических систем. Преобладающее использование LD в настоящее время заключается в изучении биомакромолекул ( например, ДНК ), а также синтетических полимеров .

LD использует линейно поляризованный свет, который является светом, поляризованным только в одном направлении. Это создает волну, вектор электрического поля , который колеблется только в одной плоскости, что приводит к классической синусоидальной форме волны, когда свет проходит через пространство. Используя свет параллельно и перпендикулярно направлению ориентации, можно измерить, насколько больше энергии поглощается в одном измерении молекулы по сравнению с другим, предоставляя информацию экспериментатору.

При взаимодействии света с исследуемой молекулой, если молекула начнет поглощать свет, то электронная плотность внутри молекулы сместится, поскольку электрон станет фотовозбужденным . Это перемещение заряда известно как электронный переход , направление которого называется поляризацией электрического перехода. Именно для этого свойства LD является измерением.

LD ориентированной молекулы можно рассчитать с помощью следующего уравнения:

ЛД = А _║ - А _┴

Где A _║ — поглощение, параллельное оси ориентации, а A _┴ — поглощение, перпендикулярное оси ориентации.

Обратите внимание, что для генерации сигнала LD можно использовать свет любой длины волны.

Генерируемый сигнал LD, следовательно, имеет два предела для сигнала, который может быть сгенерирован. Для химической системы, электрический переход которой параллелен оси ориентации, можно записать следующее уравнение:

ЛД = А _║ - А _┴ = А _║ > 0

Для большинства химических систем это представляет собой электрический переход, поляризованный по длине молекулы (т.е. параллельно оси ориентации).

В качестве альтернативы можно обнаружить, что поляризация электрического перехода идеально перпендикулярна ориентации молекулы, что приводит к следующему уравнению:

ЛД = А _║ - А _┴ = - А _┴ < 0

Это уравнение представляет собой сигнал LD, зарегистрированный, если электрический переход поляризован по ширине молекулы (т.е. перпендикулярно оси ориентации), которая в случае LD является меньшей из двух исследуемых осей.

Поэтому LD можно использовать двумя способами. Если ориентация молекул в потоке ^{[ необходимо разъяснение ]} известна, то экспериментатор может посмотреть на направление поляризации в молекуле (что дает представление о химической структуре молекулы), или, если направление поляризации неизвестно, его можно использовать как средство для определения того, насколько ориентирована молекула в потоке.

Ультрафиолетовая (УФ) LD обычно применяется при анализе биологических молекул, особенно больших, гибких, длинных молекул, структуру которых трудно определить такими методами, как ЯМР и рентгеновская дифракция .

ДНК почти идеально подходит для обнаружения UV LD. Молекула очень длинная и очень тонкая, что позволяет легко ориентировать ее в потоке. Это приводит к сильному сигналу LD. Системы ДНК, которые были изучены с использованием UV LD, включают комплексы ДНК- фермент и комплексы ДНК- лиганд , ^[2] образование последних легко наблюдать с помощью кинетических экспериментов.

Фибриллярные белки , такие как белки, участвующие в болезни Альцгеймера, и прионные белки, соответствуют требованиям UV LD, поскольку они представляют собой класс длинных тонких молекул. Кроме того, цитоскелетные белки ^[3] также могут быть измерены с помощью LD.

Встраивание мембранных белков в липидную мембрану отслеживалось с помощью LD, предоставляя экспериментатору информацию об ориентации белка относительно липидной мембраны в различные моменты времени.

Кроме того, с помощью УФ-ЛД были проанализированы другие типы молекул, включая углеродные нанотрубки ^[4] и связанные с ними лигандные комплексы.

Система ориентации потока Куэтта является наиболее широко используемым методом ориентации образца для УФ-LD. Она имеет ряд характеристик, которые делают ее весьма подходящей в качестве метода выравнивания образца. Поток Куэтта в настоящее время является единственным установленным средством ориентации молекул в фазе раствора. Этот метод также требует только очень малых количеств анализируемого образца (20–40 мкл) для генерации спектра LD. Постоянная рециркуляция образца является еще одним полезным свойством системы, позволяющим проводить многократные повторные измерения каждого образца, уменьшая влияние шума на конечный записанный спектр.

Его принцип работы очень прост: образец зажат между вращающейся трубкой и неподвижным стержнем. Когда образец вращается внутри ячейки, световой луч просвечивает через образец, параллельное поглощение рассчитывается из горизонтально поляризованного света, перпендикулярное поглощение — из вертикально поляризованного света. В настоящее время единственным коммерчески доступным средством ориентации LD является метод Couette flow UV LD.

Линейный дихроизм растянутой пленки — это метод ориентации, основанный на включении молекул образца в полиэтиленовую пленку. ^[5] Затем полиэтиленовая пленка растягивается, заставляя случайно ориентированные молекулы на пленке «следовать» за движением пленки. Растяжение пленки приводит к тому, что молекулы образца ориентируются в направлении растяжения.

LD очень похож на круговой дихроизм (CD), но с двумя важными отличиями. (i) Спектроскопия CD использует кругово поляризованный свет, тогда как LD использует линейно поляризованный свет. (ii) В экспериментах с CD молекулы обычно свободны в растворе, поэтому они ориентированы случайным образом. Наблюдаемый спектр тогда является функцией только хиральной или асимметричной природы молекул в растворе. В случае биомакромолекул CD особенно полезен для определения вторичной структуры. Напротив, в экспериментах с LD молекулы должны иметь преимущественную ориентацию, в противном случае LD = 0. В случае биомакромолекул часто используется ориентация потока, другие методы включают растянутые пленки, магнитные поля и сжатые гели. Таким образом, LD дает такую ​​информацию, как выравнивание на поверхности или связывание небольшой молекулы с ориентированной потоком макромолекулой, наделяя ее функциональностью, отличной от других спектроскопических методов. Различия между LD и CD являются взаимодополняющими и могут быть мощным средством для выяснения структуры биологических молекул при использовании их в сочетании друг с другом, комбинация методов раскрывает гораздо больше информации, чем один метод в отдельности. Например, CD сообщает нам, когда мембранный пептид или белок сворачивается, тогда как LD сообщает, когда он встраивается в мембрану. ^[6]

Линейный дихроизм, обнаруженный флуоресценцией (FDLD), является очень полезным методом для экспериментатора, поскольку он сочетает в себе преимущества УФ-ЛД, а также предлагает конфокальное обнаружение флуоресцентного излучения. ^[7] FDLD применяется в микроскопии, где может использоваться как средство двумерного картирования поверхности с помощью дифференциальной поляризационной спектроскопии (DPS), где анизотропия сканируемого объекта позволяет записывать изображение. FDLD также может использоваться в сочетании с интеркалирующими флуоресцентными красителями (которые также можно контролировать с помощью УФ-ЛД). Разница в интенсивности, зарегистрированная между двумя типами поляризованного света для считывания флуоресценции, пропорциональна сигналу УФ-ЛД, что позволяет использовать DPS для получения изображений поверхностей.