P-элемент

Элементы P являются мобильными элементами , которые были обнаружены у Drosophila как возбудители генетических признаков, называемых гибридным дисгенезом. Транспозон отвечает за признак P элемента P и встречается только у диких мух. Они также встречаются у многих других эукариот. ^[1]

Название было впервые предложено эволюционным биологом Маргарет Кидвелл , которая вместе с Джеймсом Кидвеллом и Джоном Сведом исследовала гибридный дисгенез у дрозофилы . Они называли штаммы P отцовским и M материнским, если они способствовали гибридному дисгенезу в этой репродуктивной роли. ^[2]

Элемент P кодирует фермент, известный как P -транспозаза . В отличие от самок, выведенных в лабораторных условиях, считается, что самки дикого типа также экспрессируют ингибитор функции P -транспозазы, вырабатываемый тем же самым элементом. Этот ингибитор уменьшает нарушение генома, вызванное перемещением элементов P , что позволяет производить плодовитое потомство. Доказательства этого получены в результате скрещивания лабораторных самок (у которых отсутствует ингибитор P -транспозазы) с самцами дикого типа (у которых есть элементы P ). При отсутствии ингибитора элементы P могут распространяться по всему геному, нарушая работу многих генов и часто оказываясь смертельными для потомства или делая его бесплодным.

Элементы P обычно используются в качестве мутагенных агентов в генетических экспериментах с Drosophila . Одним из преимуществ этого подхода является то, что мутации легко обнаружить. При гибридном дисгенезе один штамм Drosophila спаривается с другим штаммом Drosophila , производя гибридное потомство и вызывая хромосомные повреждения, известные как дисгенные. Гибридный дисгенез требует вклада от обоих родителей. Например, в системе PM , где штамм P вносит отцовский вклад, а штамм M вносит материнский вклад, может произойти дисгенез. Обратное скрещивание с отцом цитотипа M и матерью P дает нормальное потомство, поскольку оно скрещивается по типу P x P или M x M. Хромосомы самца P могут вызывать дисгенез при скрещивании с самкой M.

Элемент P является транспозоном класса II и перемещается с помощью механизма «вырезать и вставить» на основе ДНК. Последовательность распознавания состоит из четырех экзонов, разделенных тремя интронами . ^[3] Полный сплайсинг интронов производит фермент транспозазу, в то время как альтернативный частичный сплайсинг интронов 1 и 2, оставляющий только интрон 3 в транскрипте мРНК, кодирует репрессор элемента P. Полный, автономный элемент P кодирует фермент транспозазу, который распознает 31 -пн концевые инвертированные повторы на обоих концах элемента P и катализирует вырезание и повторную вставку элемента P. Полный элемент имеет длину 2907 пн; неавтономные элементы P содержат внутреннюю делецию различной длины, которая отменяет выработку транспозазы, но такие элементы все еще могут быть мобилизованы, если функциональная транспозаза закодирована в другом месте генома. Вставка P- элемента и последующее вырезание обязательно оставляют после себя 8-пн прямые повторы в месте вырезания; таким образом, наличие таких повторов указывает на предыдущую активность P- элемента.

Все элементы P имеют каноническую структуру, содержащую 31-пн концевые инвертированные повторы и 11-пн внутренние инвертированные повторы, расположенные в домене THAP транспозазы. Самые короткие и самые длинные элементы P являются неавтономными элементами. Самые длинные элементы P кодируют транспозазу, необходимую для транспозиции. Та же последовательность, которая кодирует транспозазу, кодирует также супрессор транспозиции, который накапливается в цитоплазме во время развития клеток. Таким образом, при скрещивании самца P или M с самкой P женская цитоплазма содержит супрессор, который связывается с любыми элементами P и предотвращает их транспозицию.

Гибридный дисгенез относится к высокой частоте мутаций в клетках зародышевой линии штаммов Drosophila , возникающих в результате скрещивания самцов с автономными элементами P (штамм P / цитотип P ) и самок, у которых отсутствуют элементы P ( штамм M / цитотип M ). Синдром гибридного дисгенеза характеризуется температурно-зависимой стерильностью, повышенной частотой мутаций и повышенной хромосомной перестройкой и рекомбинацией.

Гибридный фенотип дисгенеза зависит от транспозиции элементов P в клетках зародышевой линии потомства самцов штамма P с самками штамма M. Транспозиция происходит только в клетках зародышевой линии, поскольку событие сплайсинга, необходимое для создания мРНК транспозазы, не происходит в соматических клетках.

Гибридный дисгенез проявляется при скрещивании самцов штамма P с самками штамма M , но не при скрещивании самок штамма P (самок с автономными элементами P ) с самцами штамма M. Яйцеклетки самок штамма P содержат большое количество белка -репрессора , который предотвращает транскрипцию гена транспозазы. Яйцеклетки матерей штамма M , которые не содержат белка-репрессора, допускают транспозицию элементов P из спермы отцов. У самок штамма P репрессоры находятся в цитоплазме. Следовательно, когда самцы штамма P оплодотворяют самок штамма M (цитоплазма которых не содержит репрессора), самец вносит свой геном с элементом P , но не с мужской цитоплазмой , что приводит к потомству штамма P. ^[3]

Этот эффект способствует тому, что piRNA наследуются только по материнской линии, что обеспечивает защитный механизм от P- элементов. ^[4]

Элемент P нашел широкое применение в исследованиях Drosophila в качестве мутагена. Система мутагенеза обычно использует автономный, но неподвижный элемент и мобильный неавтономный элемент. Мухи из последующих поколений затем могут быть проверены по фенотипу или ПЦР . Природные элементы P содержат кодирующую последовательность для фермента транспозазы и последовательности распознавания для действия транспозазы. Транспозаза регулирует и катализирует вырезание элемента P из ДНК хозяина, разрезая в двух сайтах распознавания, а затем повторно вставляя случайным образом. Именно случайная вставка может мешать существующим генам или нести дополнительный ген, который может использоваться для генетических исследований.

Чтобы использовать это как полезный и контролируемый генетический инструмент, две части элемента P должны быть разделены, чтобы предотвратить неконтролируемую транспозицию. Обычные генетические инструменты — это ДНК, кодирующая транспозазу без последовательностей распознавания транспозазы, чтобы она не могла вставиться, и « плазмида P ». Плазмиды P всегда содержат репортерный ген Drosophila , часто маркер красных глаз (продукт гена white ), и последовательности распознавания транспозазы. Они могут содержать интересующий ген, селективный маркерный ген E. coli , часто какой-то вид устойчивости к антибиотикам , начало репликации или другие связанные с плазмидой последовательности «домашнего хозяйства».

Существует два основных способа использования этих инструментов:

1. Клонируйте элемент P в плазмиду, трансформируйте и вырастите ее в бактериях.
2. Удалите P -транспозазу и замените ее интересующим вас геном.
3. Микроинъекция в задний конец эмбриона на ранней стадии (до целлюляризации) ДНК, кодирующей транспозазу, и плазмиды с репортерным геном, интересующим геном и последовательностями распознавания транспозазы.
4. Происходит случайная транспозиция, в результате которой вставляются интересующий ген и ген-репортер.
5. После того, как нужный ген вставлен, он больше не является подвижным, поскольку не может вырабатывать собственную P- транспозазу.
6. Вырастите мух и скрестите их, чтобы удалить генетические различия между клетками организма. (Только некоторые клетки организма будут трансформированы. Будем надеяться, что некоторые из этих трансформированных клеток попадут в зародышевую линию. Трансформированная гамета даст начало организму, не имеющему никаких различий между его клетками).
7. Ищите мух, экспрессирующих репортерный ген. Они несут вставленный интересующий ген, поэтому их можно исследовать, чтобы определить фенотип, обусловленный интересующим геном.

Вставленный ген мог повредить функцию одного из генов хозяина. Требуется несколько линий мух, чтобы можно было провести сравнение и убедиться, что никакие дополнительные гены не были выбиты.

1. Микроинъекция в эмбрион ДНК, кодирующей транспозазу, и плазмиды с репортерным геном и последовательностями распознавания транспозазы (а часто и репортерным геном E. coli , точкой начала репликации и т. д.).
2. Происходит случайная транспозиция, вставляя ген-репортер случайным образом. Вставка имеет тенденцию происходить вблизи активно транскрибируемых генов, так как именно там структура хроматина наиболее рыхлая, поэтому ДНК наиболее доступна.
3. Выращивайте мух и скрещивайте их, чтобы устранить генетические различия между клетками организма (см. выше).
4. Ищите мух, экспрессирующих репортерный ген. Они пережили успешную транспозицию, поэтому их можно исследовать, чтобы определить фенотип из-за мутации существующих генов.

Возможные мутации:

1. Вставка в транслируемую область => гибридный белок/усеченный белок. Обычно вызывает потерю функции белка, хотя наблюдаются и более сложные эффекты.
2. Вставка в интрон => измененный рисунок сплайсинга /неудача сплайсинга. Обычно приводит к усечению белка или образованию неактивных неправильно сплайсированных продуктов, хотя более сложные эффекты встречаются часто.
3. Вставка в 5' (последовательность, которая станет 5' UTR мРНК) нетранслируемой области => усечение транскрипта. Обычно приводит к тому, что мРНК не содержит 5' кэп , что приводит к менее эффективной трансляции.
4. Вставка в промотор => снижение/полная потеря экспрессии. Всегда приводит к значительному снижению уровня продукции белка. Наиболее полезный тип вставки для анализа из-за простоты ситуации.
5. Вставка между промотором и вышестоящими энхансерами => потеря функции энхансера/перехват функции энхансера для репортерного гена.† Обычно снижает уровень специфичности белка к типу клеток, хотя часто наблюдаются сложные эффекты.

Захват энхансера из другого гена позволяет анализировать функцию этого энхансера. Это, особенно если репортерный ген относится к флуоресцентному белку, может быть использовано для картирования экспрессии мутировавшего гена в организме и является очень мощным инструментом. Это полезный инструмент для изучения паттернов экспрессии генов (временных и пространственных).

Эти методы называются обратной генетикой. Обратная генетика — это подход к обнаружению функции гена путем анализа фенотипических эффектов определенных последовательностей генов, полученных путем секвенирования ДНК.

После определения функции мутировавшего белка можно секвенировать/очистить/клонировать области, фланкирующие вставку, следующими методами:

1. Выделите геном мухи.
2. Пройти легкую обработку (с использованием фермента [фермент 1], который, как известно, НЕ разрезает репортерный ген), в результате чего получаются фрагменты размером в несколько килобаз, несколько из которых содержат вставку и прилегающую к ней ДНК.
3. Самолигируйте гидролизат (низкая концентрация ДНК для обеспечения самолигирования), получая выборку кольцевых фрагментов ДНК, несколько из которых содержат вставку и фланкирующую ее ДНК.
4. Разрежьте плазмиды в определенной точке гена-репортера (с помощью фермента [фермента 2], который, как известно, очень редко разрезает геномную ДНК, но делает это в гене-репортере).
5. Используя праймеры для участков репортерного гена, можно амплифицировать ДНК для секвенирования .

Процесс разрезания, самолигирования и повторного разрезания позволяет амплифицировать фланкирующие области ДНК без знания последовательности. Точку, в которой произошло лигирование, можно увидеть, идентифицировав место разреза [фермента 1].

1. Выделите геном мухи.
2. Пройти легкое расщепление (с использованием фермента [фермент 1], который, как известно, разрезает границу между геном-репортером и геном-репортером E. coli и последовательностями плазмиды), получая фрагменты размером в несколько килобаз, несколько из которых содержат репортер E. coli , плазмидные последовательности и его фланкирующую ДНК.
3. Самолигируйте гидролизат (низкая концентрация ДНК для обеспечения самолигирования), получая выборку кольцевых фрагментов ДНК, несколько из которых содержат репортер E. coli , плазмидные последовательности и его фланкирующую ДНК.
4. Вставьте плазмиды в клетки E. coli (например, с помощью электропорации).
5. Выберите плазмиды для гена селективного маркера E. coli . Только успешные вставки плазмид с последовательностями плазмидного «домашнего хозяйства» будут экспрессировать этот ген.
6. Ген можно клонировать для дальнейшего анализа.

• Лиланд Хартвелл и др. 2004. Генетика – от генов к геномам 2-е изд. McGraw-Hill
• Энгельс, В. Р. Элементы P в дрозофиле

• ФлайБейс