Рацемаза глутамата

В энзимологии глутаматрацемаза ( MurI с большой буквы i ) ( EC 5.1.1.3) — это фермент , катализирующий химическую реакцию

L-глутамат D-глутамат${\displaystyle \rightleftharpoons}$

Следовательно, этот фермент RacE имеет один субстрат , L-глутамат , и один продукт , D-глутамат.

Этот фермент принадлежит к семейству изомераз , в частности, к рацемазам и эпимеразам, действующим на аминокислоты и их производные, включая пролинрацемазу, аспартатрацемазу и диаминопимелатэпимеразу. ^[1] Этот фермент участвует в метаболизме глутамата , который необходим для биосинтеза клеточной стенки у бактерий. ^[2] Глутаматрацемаза выполняет дополнительную функцию ингибирования гиразы , предотвращая связывание гиразы с ДНК. ^[3]

Глутаматрацемаза (MurI) выполняет две различные метаболические функции: в первую очередь, это критически важный фермент в биосинтезе клеточной стенки, ^[2] но также играет роль в ингибировании гиразы . ^[3] Способность глутаматрацемазы и других белков выполнять две различные функции известна как « совместная работа ».

До открытия лунных белков ученые в целом считали, что фермент имеет только одну функцию, что привело к концепции «один ген, один фермент». Однако эта концепция больше не применяется в науке после открытия того, что некоторые белки состоят как из основных, так и из второстепенных функций. Это привело к многочисленным исследованиям, пытающимся связать две функции друг с другом. Второстепенные функции этих уникальных ферментов называются лунными функциями, в которых белок может иметь вторичные функции, не зависящие от основной функции. Эти две функции лунного белка находятся в одной полипептидной цепи . Белки, которые являются многофункциональными, не включены из-за слияния генов, семейств гомологичных белков, вариантов сплайсинга или беспорядочной ферментативной активности. Фермент глутаматрацемаза (MurI) является примером лунного белка, функционирующего как в биосинтезе бактериальной клеточной стенки , так и в ингибировании гиразы.

Размеры MurI составляют приблизительно 35 Å × 40 Å × 45 Å и состоят из двух компактных доменов структуры α/β . ^{[1] [4]} С активным сайтом между двумя доменами, N-концевой домен содержит остатки 1-97 и 207-264, в то время как C-концевой домен включает остатки 98-206. ^[1] Это позволяет ферменту производить L-изомер из D-глутамата. Кроме того, N-домен состоит из пятицепочечных β-слоев по сравнению с четырехцепочечными β-слоями C-домена. ^[1] Эти структурные характеристики не идентичны между MurI разных видов; S. pyogenes и B. subtilis на самом деле обладают наиболее структурно схожими ферментами MurI из всех обнаруженных. Также нередко можно обнаружить MurI в виде димера .

Активный сайт, поскольку он равномерно расположен между N-доменом и C-доменом, также находится между двумя остатками цистеина . Он доступен для растворителей, так как в активном сайте находятся несколько молекул воды, таких как W1. У некоторых видов активный сайт также включает сульфатные ионы для образования водородных связей на амидной основе и боковых цепях . ^{[1] [5]}

Глутаматрацемаза — это бактериальный фермент, кодируемый геном murI . Этот фермент наиболее известен как ответственный за синтез клеточных стенок бактерий. Экспериментально было обнаружено, что этот фермент способен строить эти клеточные стенки, синтезируя D-глутамат из L-глутамата посредством рацемизации . ^[4] D-глутамат является мономером пептидогликанового слоя в клеточных стенках прокариот. Пептидогликан является важным структурным компонентом клеточной стенки бактерий. Пептидогликановый слой также отвечает за жесткость клеточной стенки. ^[6] Этот процесс, в котором MurI помогает катализировать взаимопревращение энантиомеров глутамата, таких как L-глутамат, в необходимый D-глутамат, также является независимым от кофактора. Таким образом, он может протекать без необходимости в дополнительном источнике, который связывался бы с аллостерическим сайтом, изменяя форму фермента, чтобы помочь катализировать реакцию. ^[7] Murl включает двухэтапный процесс катализа энантиомеров глутамата в D-глутамат. Первый этап - депротонирование субстрата с образованием аниона. ^[7] Затем субстрат репротонируется. Как только глутамат оказывается в активном центре фермента, он претерпевает очень большое конформационное изменение своих доменов. Это изменение помогает наложить два каталитических остатка цистеина, Cys73 и Cys184, расположенных по обе стороны субстрата в равных положениях. Эти домены, упомянутые ранее, симметричны, и эта симметрия предполагает, что эта рацемазная активность белка могла развиться из дупликации гена. ^[5] Из-за этой основной функции биосинтеза стенок бактериальных клеток MurI был нацелен на антибактериальное средство при разработке лекарств. ^[8]

Наряду со своей основной функцией биосинтеза клеточной стенки, белок-лунаматрацемаза также функционирует независимо как ингибитор гиразы. ^[2] Присутствуя в некоторых формах бактерий, MurI снижает активность ДНК-гиразы, предотвращая связывание гиразы с ДНК. ^[2] Когда гираза связывается с ДНК, фермент уменьшает натяжение в цепях ДНК по мере их раскручивания и заставляет цепи становиться сверхспирализованными. ^[9] Это критический этап репликации ДНК в этих клетках, который приводит к размножению бактериальных клеток. ^[10] Присутствие глутаматрацемазы в этом процессе препятствует эффективному связыванию гиразы с ДНК, деформируя форму активного центра фермента. По сути, это не позволяет гиразе катализировать реакцию, которая скручивает раскручивающиеся цепи ДНК. ^[10]

Эта функция MurI была обнаружена экспериментально. ДНК-гираза была инкубирована с ферментом MurI, а затем добавлена ​​к образцу ДНК; результаты этого эксперимента показали ингибирование активности суперспирализации при наличии MurI. ^[2] Функция биосинтеза клеточной стенки MurI не связана напрямую с его функцией подмены. Способность MurI ингибировать связывание гиразы может происходить независимо от его основной функции. ^[2] Это означает, что ДНК-гираза, в свою очередь, не будет иметь никакого влияния на рацемизацию MurI, что было подтверждено в исследовании рацемизации с присутствием ДНК-гиразы и без него. ^[2] В экспериментальном анализе было определено, что MurI использует использование двух различных ферментативных активных центров для своих двух функций. Это было показано путем включения субстрата рацемазы L-глутамата в анализ с разделенным сайтом ингибирования гиразы. Ингибирование гиразы происходит как при суперспирализации, так и при релаксационной активности ДНК-гиразы, и исследование пришло к выводу, что ингибирующая активность могла продолжаться без изменений в присутствии субстрата рацемазы. ^[10] Это говорит о том, что две функции могут выполняться независимо друг от друга, на неперекрывающихся участках, что делает MurI настоящим белком-«младшекурсником». ^[2] Мутантные формы MurI, которые не способны проявлять свою функцию рацемазы, независимо от того, насколько скомпрометированы были их способности к рацемазе, все же были доказаны в ходе исследования, что они способны выполнять ингибирование ДНК-гиразы с результатами, сопоставимыми с немутировавшей формой MurI. ^[10]

Глутаматрацемаза (MurI) обеспечивает множество функций для бактериальных клеток. MurI — это фермент, который в первую очередь известен своей ролью в синтезе бактериальных клеточных стенок. Выполняя функцию синтеза клеточной стенки, MurI также действует как ингибитор гиразы, предотвращая связывание гиразы с ДНК. Было показано, что эти два процесса не связаны между собой. ^[2] Для того чтобы выяснить влияние ингибирования гиразы на синтез клеточной стенки, эффективность превращения D-глутамата в L-глутамат измерялась при изменении концентрации ДНК-гиразы. Наоборот, влияние продукции клеточной стенки на ингибирование гиразы было обнаружено путем изменения концентрации субстрата рацемизации. ^[2] Результаты этих экспериментов позволяют сделать вывод, что нет существенного влияния рацемизации на ингибирование гиразы или наоборот. ^[2] Две функции MurI действуют независимо друг от друга, подтверждая тот факт, что MurI является белком-самоделкином.

Известно, что глутаматрацемаза использует свой активный центр для прохождения рацемизации и участия в пути биосинтеза клеточной стенки бактерий. ^[2] Основываясь на гомологии с другими рацемазами и эпимеразами, считается, что глутаматрацемаза использует два остатка цистеина активного центра в качестве катализаторов кислоты/основания. ^[7] Удивительно, однако, что замена любого из двух остатков серином не привела к заметному изменению скорости реакции; значение k _cat оставалось в пределах от 0,3% до 3% по сравнению с ферментом дикого типа . ^[7] Из предыдущих исследований наиболее вероятно, что активный центр MurI, который выполняет рацемизацию, не является тем же самым активным центром, который подвергается ингибированию гиразы. Чтобы выяснить влияние ингибирования гиразы на синтез клеточной стенки, эффективность преобразования D-глутамата в L-глутамат была измерена при изменении концентрации ДНК-гиразы. Наоборот, эффекты продукции клеточной стенки на ингибирование гиразы были обнаружены путем изменения концентрации субстрата рацемизации. Было показано, что эти две функции нейтральны друг к другу. ^[2] Другими словами, субстраты рацемизации нейтральны к ингибированию гиразы, а ДНК-гираза не оказывает никакого влияния на рацемизацию. Это объясняет, как глутаматрацемаза в некоторых бактериях, таких как Glr из B. subtilis , не ингибирует гиразу; ^[12] если один активный сайт участвует в обеих функциях, эта независимость была бы невозможна. Следовательно, другой сайт MurI, удаленный от его активного сайта, участвует во взаимодействии с гиразой. ^[2]

Этот белок может использовать модель аллостерической регуляции морфеина . ^[13]

Глутаматрацемаза появилась как потенциальная антибактериальная мишень, поскольку продукт этого фермента, D-глутамат, является важным компонентом бактериальных стенок. Ингибирование фермента предотвратит образование бактериальной стенки и в конечном итоге приведет к лизису бактериальной клетки под действием осмотического давления. Кроме того, глутаматрацемаза не экспрессируется и не является продуктом этого фермента, D-глутамат обычно встречается у млекопитающих, поэтому ингибирование этого фермента не должно приводить к токсичности для организма хозяина-млекопитающего. ^[5] Возможные ингибиторы MurI включают азиридиноглутамат, который алкилирует каталитические цистеины; N-гидроксиглутамат, который, имитируя Wat2 (связанную молекулу воды, которая взаимодействует с аминогруппой глутамата), предотвращает связывание субстрата; ^[5] или 4-замещенные аналоги D-глутаминовой кислоты, содержащие арил-, гетероарил-, циннамил- или биарилметилзаместители, которые также предотвращают связывание субстрата. ^[5]