Часть серии статей о |
ДНК-штрихкодирование |
---|
По таксонам |
Другой |
Штрихкодирование ДНК грибов — это процесс идентификации видов биологического царства грибов посредством амплификации и секвенирования определенных последовательностей ДНК и их сравнения с последовательностями, хранящимися в базе данных штрихкодов ДНК, такой как справочная база данных ISHAM [1] или Система данных Barcode of Life (BOLD). В этой попытке штрихкодирование ДНК опирается на универсальные гены, которые в идеале присутствуют во всех грибах с одинаковой степенью вариации последовательностей. Межвидовая вариация, т. е. вариация между видами, в выбранном гене штрихкода ДНК должна превышать внутривидовую (внутривидовую) вариацию. [2]
Фундаментальной проблемой в систематике грибов является существование телеоморфных и анаморфных стадий в их жизненных циклах. Эти морфы обычно резко различаются по своему фенотипическому виду, что не позволяет напрямую связать бесполую анаморфу с половой телеоморфой. Более того, виды грибов могут включать несколько штаммов, которые могут различаться по своей морфологии или по таким признакам, как использование углерода и азота, что часто приводило к их описанию как разных видов, в конечном итоге производя длинные списки синонимов. [3] Штрихкодирование ДНК грибов может помочь идентифицировать и связать анаморфные и телеоморфные стадии грибов и тем самым сократить запутанное множество названий грибов. По этой причине микологи были одними из первых, кто возглавил исследование дискриминации видов с помощью последовательностей ДНК, [3] [4] [5] [6] [7] [8] по крайней мере на 10 лет раньше предложения Пола Д. Н. Хеберта и его коллег о ДНК-штрихкодировании для животных в 2003 году, которые популяризировали термин «ДНК-штрихкодирование». [9] [10]
Успех идентификации грибов с помощью последовательностей ДНК-штрихкодов зависит от количественного (полнота) и качественного (уровень идентификации) аспекта справочной базы данных. Без базы данных, охватывающей широкий таксономический диапазон грибов, многие запросы на идентификацию не приведут к удовлетворительно близкому совпадению. Аналогично, без существенных кураторских усилий по поддержанию записей на высоком таксономическом уровне идентификации, запросы — даже если они могут иметь близкое или точное совпадение в справочной базе данных — не будут информативными, если ближайшее совпадение будет определено только на уровне типа или класса . [11] [12]
Другим важным условием для ДНК-штрихкодирования является возможность однозначно проследить происхождение данных ДНК-штрихкода до первоначально отобранного образца, так называемого образца-ваучера. Это обычная практика в биологии наряду с описанием новых таксонов , где образцы-ваучеры, на которых основано таксономическое описание, становятся типовыми образцами . Когда идентичность определенного таксона (или генетической последовательности в случае ДНК-штрихкодирования) вызывает сомнения, исходный образец может быть повторно исследован для рассмотрения и, в идеале, решения проблемы. Образцы-ваучеры должны быть четко обозначены как таковые, включая постоянный идентификатор ваучера, который однозначно связывает образец с данными ДНК-штрихкода, полученными из него. Кроме того, эти образцы-ваучеры должны быть помещены в общедоступные хранилища, такие как научные коллекции или гербарии, чтобы сохранить их для будущего использования и облегчить исследования с использованием помещенных образцов. [13]
У грибов внутренний транскрибируемый спейсер ( ITS ) представляет собой область длиной примерно 600 пар оснований в кластере генов тандемного повтора рибосомы ядерного генома . Область фланкирована последовательностями ДНК для малой субъединицы рибосомы (SSU) или субъединицы 18S на 5'-конце и большой субъединицей (LSU) или субъединицей 28S на 3'-конце. [14] [15] Сам внутренний транскрибируемый спейсер состоит из двух частей, ITS1 и ITS2 , которые отделены друг от друга субъединицей 5.8S , вложенной между ними. Подобно фланкирующим субъединицам 18S и 28S, субъединица 5.8S содержит высококонсервативную последовательность ДНК, поскольку они кодируют структурные части рибосомы , которая является ключевым компонентом внутриклеточного синтеза белка .
Благодаря нескольким преимуществам ITS (см. ниже) и обширному объему данных о последовательностях, накопленных в 1990-х и начале 2000-х годов, Бегеров и др. (2010) и Шох и др. (2012) предложили использовать регион ITS в качестве первичного региона штрихкода ДНК для генетической идентификации грибов . [12] [2]
UNITE [16] — это открытая база данных штрихкодов ITS для грибов и всех других эукариот.
Консервативные фланкирующие области 18S и 28S служат точками привязки для праймеров , используемых для ПЦР- амплификации области ITS . [17] Более того, консервативная вложенная область 5.8S позволяет конструировать «внутренние» праймеры, т. е. праймеры, прикрепляющиеся к комплементарным последовательностям в области ITS. Уайт и др. (1990) предложили такие внутренние праймеры, названные ITS2 и ITS3, вместе с фланкирующими праймерами ITS1 и ITS4 в субъединицах 18S и 28S соответственно. [17] Благодаря их почти универсальной применимости к секвенированию ITS у грибов, эти праймеры до сих пор широко используются. Оптимизированные праймеры специально для секвенирования ITS у Dikarya (включая Basidiomycota и Ascomycota ) были предложены Тоджу и др. (2012). [18]
Для большинства грибов праймеры ITS, предложенные Уайтом и др. (1990), стали стандартными праймерами, используемыми для ПЦР-амплификации. Эти праймеры: [17]
Прямые праймеры:
| Обратные праймеры:
|
Основным преимуществом использования региона ITS в качестве молекулярного маркера и ДНК-штрихкода грибов является то, что весь кластер рибосомных генов организован в тандемные повторы, т. е. в множественных копиях. [15] Это позволяет проводить его ПЦР-амплификацию и секвенирование по Сэнгеру даже из небольших образцов материала (при условии, что ДНК не фрагментирована из-за возраста или других дегенеративных влияний ). [14] Следовательно, при амплификации ITS обычно наблюдается высокий уровень успешности ПЦР . Однако этот уровень успешности сильно варьируется среди групп грибов: от 65% у не-Dikarya (включая теперь парафилетические Mucoromycotina , Chytridiomycota и Blastocladiomycota ) до 100% у Saccharomycotina и Basidiomycota [2] (за исключением очень низкого успеха у Pucciniomycotina ). [19] Кроме того, выбор праймеров для амплификации ITS может вносить смещения в сторону определенных таксономических групп грибов. [20] Например, «универсальные» праймеры ITS [17] не способны амплифицировать около 10% протестированных образцов грибов. [19]
Тандемные повторы кластера рибосомных генов вызывают проблему значительной внутригеномной гетерогенности последовательностей, наблюдаемой среди копий ITS нескольких групп грибов. [21] [22] [23] При секвенировании по Сэнгеру это приведет к тому, что прочтения последовательностей ITS разной длины будут накладываться друг на друга, что потенциально сделает полученную хроматографию нечитаемой. Кроме того, из-за некодирующей природы области ITS , которая может привести к значительному количеству инделей , невозможно последовательно выровнять последовательности ITS из сильно расходящихся видов для дальнейшего более масштабного филогенетического анализа. [9] [14] Степень внутригеномной гетерогенности последовательностей можно исследовать более подробно с помощью молекулярного клонирования изначально амплифицированных с помощью ПЦР последовательностей ITS с последующим секвенированием клонов. Эта процедура начальной ПЦР-амплификации, за которой следует клонирование ампликонов и , наконец, секвенирование клонированных ПЦР-продуктов, является наиболее распространенным подходом к получению последовательностей ITS для метабаркодирования ДНК образцов окружающей среды, в которых одновременно может присутствовать множество различных видов грибов. Однако этот подход секвенирования после клонирования редко применялся для последовательностей ITS , которые составляют референтные библиотеки, используемые для идентификации с помощью штрихкода ДНК, что потенциально приводит к недооценке существующей вариации последовательности ITS во многих образцах. [24]
Средневзвешенное арифметическое внутривидовой (внутривидовой) изменчивости ITS среди грибов составляет 2,51%. Однако эта изменчивость может варьироваться от 0%, например, у Serpula lacrymans (n=93 образца) и более 0,19% у Tuber melanosporum (n=179) до 15,72% у Rhizoctonia solani (n=608) или даже 24,75% у Pisolithus tinctorius (n=113). В случаях высокой внутривидовой изменчивости ITS применение порогового значения изменчивости последовательности в 3% — канонического верхнего значения для внутривидовой изменчивости — приведет к более высокой оценке операционных таксономических единиц (OTU), т. е. предполагаемых видов, чем их фактически имеется в образце. [25] В случае видов грибов, имеющих медицинское значение, более строгий порог изменчивости ITS в 2,5% позволяет точно идентифицировать до уровня вида только около 75% всех видов. [1]
С другой стороны, морфологически хорошо определенные, но эволюционно молодые комплексы видов или виды-братья могут отличаться (если вообще отличаться) только несколькими нуклеотидами последовательностей ITS . Таким образом, опора исключительно на данные штрихкода ITS для идентификации таких пар или комплексов видов может скрыть фактическое разнообразие и привести к неправильной идентификации, если не сопровождать это исследованием морфологических и экологических признаков и/или сравнением дополнительных диагностических генетических маркеров . [19] [24] [26] [27] Для некоторых таксонов ITS (или его часть ITS2 ) недостаточно изменчив, как грибковый ДНК-штрихкод, как, например, было показано у Aspergillus , Cladosporium , Fusarium и Penicillium . [28] [29] [30] [31] Таким образом, попытки определить универсально применимое пороговое значение изменчивости ITS , которое разграничивает внутривидовую и межвидовую (межвидовую) изменчивость, остаются тщетными. [25]
Тем не менее, вероятность правильной идентификации вида с помощью региона ITS высока в Dikarya , и особенно в Basidiomycota , где даже часть ITS1 часто достаточна для идентификации вида. [32] Однако ее дискриминационная способность частично заменяется способностью ДНК-направленной РНК-полимеразы II субъединицы RPB1 (см. также ниже). [2]
Из-за недостатков ITS как первичного ДНК-штрихкода грибов была выражена необходимость создания второго маркера ДНК-штрихкода. [9] Было предпринято несколько попыток создания других генетических маркеров, которые могли бы служить дополнительными ДНК-штрихкодами, [19] [33] [34] аналогично ситуации в растениях , где пластидные гены rbcL , matK и trnH-psbA , а также ядерный ITS часто используются в комбинации для ДНК-штрихкодирования. [35]
Фактор удлинения трансляции 1α является частью комплекса фактора удлинения эукариот 1 , основная функция которого заключается в содействии удлинению аминокислотной цепи полипептида в процессе трансляции экспрессии гена . [36]
Stielow et al. (2015) исследовали ген TEF1α , среди прочих, как потенциальный генетический маркер для ДНК-штрихкодирования грибов. Ген TEF1α , кодирующий фактор трансляционной элонгации 1α, как правило, считается имеющим медленную скорость мутации , и поэтому он, как правило, лучше подходит для исследования более старых расщеплений, более глубоких в филогенетической истории группы организмов. Несмотря на это, авторы приходят к выводу, что TEF1α является наиболее перспективным кандидатом на роль дополнительного маркера ДНК-штрихкода в грибах, поскольку он также имеет области последовательностей с более высокой скоростью мутаций. [19] После этого была создана справочная база данных с контролируемым качеством, которая была объединена с ранее существовавшей базой данных ISHAM-ITS для ДНК-штрихкодов грибов ITS [1] для формирования базы данных ISHAM. [37]
TEF1α успешно использовался для идентификации нового вида Cantharellus из Техаса и отличия его от морфологически похожего вида. [38] Однако в родах Ochroconis и Verruconis (Sympoventuriaceae, Venturiales) маркер не позволяет различать все виды. [39] TEF1α также использовался в филогенетическом анализе на уровне рода, например, в случае Cantharellus [40] и энтомопатогенного Beauveria [41] , а также для филогенетики ранних расходящихся линий грибов. [42]
Праймеры TEF1α , использованные в широкомасштабном скрининге производительности кандидатов на роль генов ДНК-штрихкода Stielow et al. (2015), представляли собой прямой праймер EF1-983F с последовательностью 5'-GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT-3' и обратный праймер EF1-1567R с последовательностью 5'-ACHGTRCCRATACCACCRATCTT-3' . [41] Кроме того, был разработан ряд новых праймеров, причем пара праймеров, выделенная жирным шрифтом, дала высокий средний успех амплификации в 88%: [19]
Прямые праймеры:
| Обратные праймеры:
|
Праймеры, используемые для исследования Rhizophydiales и особенно Batrachochytrium dendrobatidis , патогена амфибий, представляют собой прямой праймер tef1F с нуклеотидной последовательностью 5'-TACAARTGYGGTGGTATYGACA-3' и обратный праймер tef1R с последовательностью 5'-ACNGACTTGACYTCAGTRGT-3' . [43] Эти праймеры также успешно амплифицировали большинство видов Cantharellus, исследованных Buyck et al. (2014), за исключением нескольких видов, для которых были разработаны более специфичные праймеры: прямой праймер tef-1Fcanth с последовательностью 5'-AGCATGGGTDCTYGACAAG-3' и обратный праймер tef-1Rcanth с последовательностью 5'-CCAATYTTRTAYACATCYTGGAG-3' . [40]
Домен D1/D2 является частью ядерной большой субъединицы ( 28S ) рибосомальной РНК, и поэтому он расположен в том же кластере генов тандемного повтора рибосомы, что и внутренний транскрибируемый спейсер ( ITS ). Но в отличие от некодирующих последовательностей ITS, домен D1/D2 содержит кодирующую последовательность. Приблизительно с 600 парами оснований он имеет примерно ту же длину нуклеотидной последовательности, что и ITS , [44], что делает амплификацию и секвенирование довольно простыми, преимущество, которое привело к накоплению большого количества данных о последовательностях D1/D2, особенно для дрожжей . [3] [7] [44]
Что касается молекулярной идентификации базидиомицетовых дрожжей, D1/D2 (или ITS ) можно использовать отдельно. [44] Однако Фелл и др. (2000) и Скорцетти и др. (2002) рекомендуют комбинированный анализ регионов D1/D2 и ITS , [3] [44] практика, которая позже стала стандартной требуемой информацией для описания новых таксонов аско- и базидиомицетовых дрожжей. [14] При попытке идентифицировать ранние расходящиеся грибковые линии исследование Шоха и др. (2012), сравнивающее эффективность идентификации различных генетических маркеров, показало, что большая субъединица (а также малая субъединица ) рибосомальной РНК работает лучше, чем ITS или RPB1 . [2]
Для базидиомицетовых дрожжей прямой праймер F63 с последовательностью 5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3' и обратный праймер LR3 с последовательностью 5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3' были успешно использованы для ПЦР-амплификации домена D1/D23. [3] Домен D1/D2 аскомицетовых дрожжей, таких как Candida, можно амплифицировать с помощью прямого праймера NL-1 (такого же, как F63 ) и обратного праймера NL-4 (такого же, как LR3 ). [6]
Субъединица РНК-полимеразы II RPB1 является крупнейшей субъединицей РНК-полимеразы II . У Saccharomyces cerevisiae она кодируется геном RPO21 . [46] Успешность ПЦР- амплификации RPB1 сильно зависит от таксона, варьируясь от 70 до 80% у Ascomycota до 14% у ранних расходящихся линий грибов. [2] Помимо ранних расходящихся линий, RPB1 имеет высокую скорость идентификации видов во всех группах грибов. У богатых видами Pezizomycotina она даже превосходит ITS. [2]
В исследовании, сравнивающем эффективность идентификации четырех генов, RPB1 оказался среди наиболее эффективных генов при объединении двух генов в анализе: комбинированный анализ либо с ITS , либо с большой субъединицей рибосомальной РНК дал наивысший успех идентификации. [2]
В других исследованиях также использовался RPB2 , вторая по величине субъединица РНК-полимеразы II, например, для изучения филогенетических связей между видами рода Cantharellus [40] или для филогенетического исследования, проливающего свет на связи между ранними дивергентными линиями в царстве грибов. [42]
Праймеры, успешно амплифицирующие RPB1, особенно в Ascomycota, представляют собой прямой праймер RPB1-Af с последовательностью 5'-GARTGYCCDGGDCAYTTYGG-3' и обратный праймер RPB1-Ac-RPB1-Cr с последовательностью 5'-CCNGCDATNTCRTTRTCCATRTA-3' . [2]
Межгенный спейсер ( IGS ) — это область некодирующей ДНК между отдельными тандемными повторами кластера рибосомных генов в ядерном геноме , в отличие от внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS), который расположен внутри этих тандемных повторов.
IGS успешно использовался для дифференциации штаммов Xanthophyllomyces dendrorhous [47], а также для различения видов в психрофильном роде Mrakia ( Cystofilobasidiales ). [48] Благодаря этим результатам IGS был рекомендован в качестве генетического маркера для дополнительной дифференциации (наряду с D1/D2 и ITS ) близкородственных видов и даже штаммов в пределах одного вида у базидиомицетовых дрожжей. [3]
Недавнее открытие дополнительных некодирующих генов РНК в области IGS некоторых базидиомицетов предостерегает от некритического использования последовательностей IGS для ДНК-штрихкодирования и филогенетических целей. [49]
Ген субъединицы цитохром с оксидазы I ( COI ) превосходит ITS в ДНК-штрихкодировании видов Penicillium (Ascomycota), с видоспецифичными штрихкодами для 66% исследованных видов по сравнению с 25% в случае ITS . Кроме того, часть гена β-тубулина A ( BenA ) демонстрирует более высокое таксономическое разрешение в различении видов Penicillium по сравнению с COI и ITS . [50] Однако в близкородственном комплексе Aspergillus niger COI недостаточно изменчив для различения видов. [51] У Fusarium COI во многих случаях демонстрирует паралоги , а гомологичные копии недостаточно изменчивы для различения видов. [52]
COI также плохо работает при идентификации базидиомикотов ржавчины порядка Pucciniales из-за наличия интронов . Даже когда препятствие интронов преодолено, ITS и LSU рРНК ( 28S ) превосходят COI в качестве маркера штрихкода ДНК. [53] В подразделении Agaricomycotina успех ПЦР-амплификации был плохим для COI , даже с несколькими комбинациями праймеров. Успешно секвенированные образцы COI также включали интроны и возможные паралогичные копии, как сообщалось для Fusarium . [52] [54] Было обнаружено, что Agaricus bisporus содержит до 19 интронов, что делает ген COI этого вида самым длинным зарегистрированным, с 29 902 нуклеотидами. [55] Помимо существенных проблем секвенирования COI , COI и ITS в целом одинаково хорошо работают при различении базидиомикотов грибов. [54]
Топоизомераза I ( TOP1 ) была исследована в качестве дополнительного кандидата на роль ДНК-штрихкода Льюисом и др. (2011) на основе данных протеома , а разработанная универсальная пара праймеров [33] была впоследствии протестирована на реальных образцах Стилоу и др. (2015). Прямой праймер TOP1_501-F с последовательностью 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-ACGAT-ACTGCCAAGGTTTTCCGTACHTACAACGC-3' (где первая часть обозначает хвост универсального прямого праймера M13, вторая часть состоит из ACGAT, спейсера, а третья часть — собственно праймер) и обратный праймер TOP1_501-R с 5'-CAGGAAACAGCTATGA-CCCAGTCCTCGTCAACWGACTTRATRGCCCA-3' (первая часть обозначает хвост универсального обратного праймера M13, вторая часть — собственно обратный праймер TOP1) амплифицируют фрагмент приблизительно из 800 пар оснований. [19]
TOP1 оказался перспективным кандидатом на роль ДНК-штрихкода для аскомицетов, где он может различать виды в родах Fusarium и Penicillium , в которых первичный ITS- штрихкод работает плохо. Однако слабый успех амплификации с универсальными праймерами TOP1 наблюдается в ранних расходящихся грибковых линиях и базидиомицетах, за исключением Pucciniomycotina (где ITS- ПЦР работает плохо). [19]
Как и TOP1 , фосфоглицераткиназа ( PGK ) была среди генетических маркеров, исследованных Льюисом и др. (2011) и Стилоу и др. (2015) в качестве потенциальных дополнительных грибковых ДНК-штрихкодов. Был разработан ряд универсальных праймеров [33] , при этом пара праймеров PGK533, амплифицирующая фрагмент длиной около 1000 пар оснований, оказалась наиболее успешной у большинства грибов, за исключением базидиомицетов. Как и TOP1 , PGK превосходит ITS в дифференциации видов в родах аскомицетов, таких как Penicillium и Fusarium , и как PGK , так и TOP1 работают так же хорошо, как TEF1α, в различении близкородственных видов в этих родах. [19]
Проект гражданской науки исследовал консенсус между маркировкой сушеных, продаваемых в коммерческих целях грибов и результатами ДНК-штрихкодирования этих грибов. Было обнаружено, что все образцы были правильно маркированы. Однако препятствием была ненадежность справочных баз данных ITS с точки зрения уровня идентификации, поскольку две базы данных (GenBank и UNITE), используемые для сравнения последовательностей ITS, давали разные результаты идентификации в некоторых образцах. [56] [57]
Правильная маркировка грибов, предназначенных для потребления, также была исследована Раджа и др. (2016), которые использовали область ITS для штрихкодирования ДНК из сушеных грибов, порошков мицелия и капсул диетических добавок . Только в 30% из 33 образцов этикетка продукта правильно указывала биномиальное название гриба. В других 30% случаев название рода было правильным, но видовой эпитет не совпадал, а в 15% случаев даже название рода биномиального названия, указанного на этикетке продукта, не совпадало с результатом полученного штрихкода ITS . Для оставшихся 25% образцов не удалось получить последовательность ITS . [58]
Сян и др. (2013) показали, что с помощью последовательностей ITS можно надежно идентифицировать до уровня вида коммерчески ценный гусеничный гриб Ophiocordyceps sinensis и его поддельные версии ( O. nutans , O. robertsii , Cordyceps cicadae , C. gunnii , C. militaris и растение Ligularia hodgsonii ). [59]
Исследование Vi Hoang et al. (2019) было сосредоточено на точности идентификации патогенных грибов с использованием как первичных ( ITS ), так и вторичных ( TEF1α ) маркеров штрихкода. Их результаты показывают, что у Diutina (сегрегат Candida [60] ) и Pichia идентификация видов проста как с помощью ITS , так и с помощью TEF1α , а также с помощью комбинации обоих. В сообществе Lodderomyces , которое содержит три из пяти наиболее распространенных патогенных видов Candida ( C. albicans , C. dubliniensis и C. parapsilosis ), ITS не смог различить Candida orthopsilosis и C. parapsilosis , которые являются частью комплекса Candida parapsilosis близкородственных видов. [61] TEF1α , с другой стороны, позволил идентифицировать все исследованные виды клады Lodderomyces . Похожие результаты были получены для видов Scedosporium , которые приписываются широкому спектру локализованных и инвазивных заболеваний: ITS не смог отличить S. apiospermum от S. boydii , тогда как с TEF1α все исследованные виды этого рода могли быть точно идентифицированы. Таким образом, это исследование подчеркивает полезность применения более одного маркера штрихкодирования ДНК для идентификации видов грибов. [62]
Штрихкодирование ДНК грибов успешно применялось для исследования феномена «лисицы» , серьезной проблемы в сохранении бумажных документов . Секейра и др. (2019) секвенировали ITS из пятен «лисицы» и обнаружили, что Chaetomium globosum , Ch. murorum , Ch. nigricolor , Chaetomium sp., Eurotium rubrum , Myxotrichum deflexum , Penicillium chrysogenum , P. citrinum , P. commune , Penicillium sp. и Stachybotrys chartarum населяют исследуемые пятна на бумаге. [63]
В другом исследовании изучались грибы, которые действуют как биодеградирующие агенты в Старом соборе Коимбры , части Университета Коимбры , объекта Всемирного наследия ЮНЕСКО . Секвенирование штрих-кода ITS десяти образцов с помощью классического метода Сенгера , а также с помощью методов секвенирования следующего поколения Illumina , позволило идентифицировать 49 видов грибов. Aspergillus versicolor , Cladosporium cladosporioides , C. sphaerospermum , C. tenuissimum , Epicoccum nigrum , Parengyodontium album , Penicillium brevicompactum , P. crustosum , P. glabrum , Talaromyces amestolkiae и T. stollii были наиболее распространенными видами, выделенными из образцов. [64]
Другое исследование, касающееся объектов культурного наследия , изучало разнообразие грибов на холсте картины Паулы Рего с использованием подрегиона ITS2 маркера ITS . Всего было обнаружено 387 OTU (предполагаемых видов) в 117 родах 13 различных классов грибов. [65]