Фракционирование потока в полевых условиях

Для проверки этой статьи нужны дополнительные цитаты . Помогите улучшить эту статью , добавив ссылки на надежные источники . Материалы без ссылок могут быть оспорены и удалены. Найти источники:  «Field flow Fractionation» – новости  · газеты  · книги  · ученый  · JSTOR ( май 2022 г. ) ( Узнайте, как и когда удалять это сообщение )

Фракционирование в потоке поля , сокращенно FFF , ^[1] — это метод разделения, изобретенный Дж. Кэлвином Гиддингсом . Метод основан на разделении коллоидных или высокомолекулярных веществ в жидких растворах, протекающих через разделительную платформу, которая не имеет неподвижной фазы . Он похож на жидкостную хроматографию, так как работает с разбавленными растворами или суспензиями растворенного вещества, переносимого текущим элюентом. Разделение достигается путем применения поля (гидравлического, центробежного, ^[2] теплового, ^[3] электрического, ^[4] магнитного, ^[5] гравитационного, ...) или поперечного потока, перпендикулярного направлению транспортировки образца, который прокачивается через длинный и узкий ламинарный канал. Поле оказывает силу на компоненты образца, концентрируя их по направлению к одной из стенок канала, которая называется стенкой накопления. ^[6] Сила взаимодействует со свойством образца, в результате чего происходит разделение, другими словами, компоненты показывают различную «подвижность» под действием силы, оказываемой пересекающим полем. Например, для гидравлического или поперечно-поточного метода FFF свойством, определяющим разделение, является коэффициент трансляционной диффузии или гидродинамический размер. Для теплового поля (нагревающего одну стенку и охлаждающего другую) это отношение коэффициента термической и трансляционной диффузии.

FFF применим в субмикронном диапазоне (от 1 нм до нескольких микрон) в «нормальном» режиме или до 50 микрон в так называемом стерическом ^{[7] [8]} режиме. Переход от нормального к стерическому режиму происходит, когда диффузия становится незначительной при размерах свыше микрона . FFF уникален своим широким динамическим диапазоном размеров, охватывающим как растворимые макромолекулы ^[9] , так и частицы или коллоиды, которые можно разделить за один анализ.

Типичными областями применения являются полимеры с высокой молекулярной массой и полимерные композиты, наночастицы (как промышленные, так и экологические), вирусы и вирусоподобные частицы, липидные наночастицы, внеклеточные везикулы и другие типы биологических образцов.

FFF можно связать со всеми типами детекторов, известных из ВЭЖХ или SEC. Из-за сходства FFF с жидкостной хроматографией в способах прохождения жидкой подвижной фазы через канал наиболее распространенными детекторами являются те, которые также используются для LC. Наиболее часто используется детектор UV-VIS из-за его неразрушающей природы. Связи с многоугловым рассеянием света позволяют рассчитать размер элюирующих фракций и сравнить со значениями, полученными с помощью теории FFF. Другим популярным специфическим обнаружением является масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой для характеристики металлических наночастиц с высокой специфичностью и чувствительностью.

FFF предлагает физическое разделение сложных и неоднородных образцов, которые потенциально не могут быть охарактеризованы другими методами разделения, такими как хроматография с исключением по размеру . Поскольку нет неподвижной фазы, меньше взаимодействия с поверхностями или материалами набивки колонки. Разделение настраивается путем модуляции силы поля разделения. FFF является щадящим методом и не оказывает физического воздействия на хрупкие образцы, а раствор-носитель может быть адаптирован с учетом наилучшей стабильности образца. FFF имеет хорошо проработанную теорию, которую можно использовать для поиска условий разделения для достижения оптимального результата без серии экспериментов методом проб и ошибок. Также можно извлечь информацию о физических параметрах фракций образца из теории FFF, хотя почти все пользователи в основном полагаются на детекторы рассеяния света для измерения размера элюирующих фракций образца.

FFF не работает для малых молекул из-за их быстрой диффузии. Для эффективного разделения образец должен быть сконцентрирован очень близко к стенке накопления (расстояние менее 10 мкм), что требует, чтобы скорость дрейфа, вызванная силовым полем, была на два порядка выше по сравнению с коэффициентом диффузии. Максимальная напряженность поля, которая может быть создана в канале FFF, определяет нижний диапазон размеров разделения. Для современных приборов это приблизительно 1 нм.

Хотя FFF является чрезвычайно универсальной техникой, не существует метода «один размер подходит всем» для всех приложений. Различные методы FFF требуют специализированного оборудования. В настоящее время только так называемое асимметричное фракционирование поля потока (AF4) ^[10] получило широкое распространение. Другие методы, такие как центробежный, тепловой или электрический FFF, все еще имеют свою нишу.

FFF ведет себя иначе, чем колоночная хроматография, и может быть нелогичным для пользователей ВЭЖХ или SEC. Понимание принципа работы FFF имеет жизненно важное значение для успешного применения метода.

FFF был разработан и впервые опубликован Дж. Кэлвином Гиддингсом в 1966 ^[11] и в 1976. ^[1] Гиддингс опубликовал много статей о Flow-FFF ^[12] , который является наиболее важной технологией FFF на сегодняшний день. Гиддингс, которому приписывают изобретение FFF, был профессором химии и специалистом по хроматографии и методам разделения в Университете Юты .

Как упоминалось выше, при фракционировании в полевом потоке поле может быть гидравлическим (с поперечным потоком через полупроницаемую мембрану в качестве стенки накопления), гравитационным , центробежным , тепловым , электрическим или магнитным . Во всех случаях механизм разделения создается за счет различий в подвижности частиц под действием сил поля в стационарном равновесии с силами диффузии : Поле вызывает нисходящую скорость дрейфа и концентрацию по направлению к стенке накопления, диффузия работает против этого градиента концентрации. Через определенное время (называемое временем релаксации) две силы уравновешиваются в стационарном равновесии. Это лучше всего визуализировать как облако частиц, со всеми компонентами в постоянном движении, но с экспоненциальным уменьшением средней концентрации, удаляясь от стенки накопления вверх в канал. Уменьшение давления воздуха при подъеме от уровня моря имеет то же экспоненциальное уменьшение, которое описывается в барометрической формуле . После достижения релаксации начинается элюирование, поскольку активируется поток канала. В тонком канале (типичная высота 250–350 мкм) существует параболический профиль скорости ламинарного потока , который характеризуется сильным увеличением скорости потока с увеличением расстояния от стенки накопления. Это определяет скорость конкретной частицы, исходя из ее равновесного положения относительно стенки канала. Частицы, расположенные ближе к стенке накопления, будут мигрировать медленнее по сравнению с другими, расположенными выше. Отношение скорости вида частицы к средней скорости жидкости называется коэффициентом удержания R. В FFF для эффективного разделения R должно быть ниже 0,2, типичные значения находятся в диапазоне от 0,02 до 0,1.

Разделение при фракционировании потока поля происходит в ламинарном канале. Он состоит из верхнего и нижнего блока, которые разделены прокладкой. Прокладка имеет вырезанную (прямоугольную или трапециевидную) пустоту, которая создает объем канала, поскольку прокладка запечатана между блоками. В качестве альтернативы канал может быть вырезан в верхнем блоке как полость. Канал спроектирован таким образом, чтобы обеспечить возможность приложения силового поля, что означает, что для каждого метода FFF необходим выделенный канал. Образец вводится в разбавленном растворе или суспензии в канал и разделяется во время миграции от входа к выходу, поскольку раствор-носитель прокачивается через канал. Ниже по потоку от выхода канала размещаются один или несколько детекторов, которые анализируют элюирующие фракции.

Гиддингс и его коллеги разработали теорию, описывающую общее уравнение удерживания, которое является общим для всех методов FFF.

Связь между разделительным силовым полем и временем удержания можно вывести из первых принципов. Рассмотрим две популяции частиц в канале FFF. Перекрестное поле перемещает оба облака частиц к нижней «накопительной» стенке. Противоположностью этому силовому полю является естественная диффузия частиц, или броуновское движение , которое производит противодействующее движение. Когда эти два процесса переноса достигают равновесия, концентрация частиц c приближается к экспоненциальной функции высоты x над накопительным стенкой, как показано в уравнении ( 1 ).

${\displaystyle c=c_{0}e^{\frac {-x}{\ell }}}$

1

${\displaystyle \ell }$представляет собой характерную высоту облака частиц. Это относится к средней высоте, которую облако частиц достигает в канале, и только когда значение отличается для популяций частиц, произойдет разделение. Для каждого компонента можно соотнести с силой, приложенной к каждой отдельной частице, или с отношением коэффициента диффузии D и скорости дрейфа U. ^[13]${\displaystyle \ell }$${\displaystyle \ell }$

${\displaystyle \ell ={\frac {kT}{F}}={\frac {D}{U}}}$

2

k — постоянная Больцмана, T — абсолютная температура, а F — сила, действующая на одну частицу со стороны силового поля. Это показывает, как характерное значение возвышения обратно пропорционально приложенной силе. Таким образом, F управляет процессом разделения. Следовательно, изменяя напряженность поля, можно контролировать разделение для достижения оптимальных уровней.

Скорость V облака молекул — это просто средняя скорость экспоненциального распределения, встроенного в параболический профиль потока.

Время удерживания, t _r, можно записать как:

${\displaystyle t_{r}={\frac {L}{V}}}$

3

Где L — длина канала.

В FFF удержание обычно выражается через коэффициент удержания, который представляет собой время пустоты t ₀ (появление неудержанного трассера), деленное на время удержания t _r . Уравнение удержания тогда становится:

${\displaystyle R={\frac {t_{0}}{t_{r}}}=6\lambda [\operatorname {coth} ({\frac {1}{2\lambda }})-2\lambda ]}$

4

где делится на w, толщину или высоту канала. Подстановка kT/F вместо иллюстрирует коэффициент удержания относительно приложенной поперечной силы.${\displaystyle \lambda }$${\displaystyle \ell }$${\displaystyle \ell }$

${\displaystyle R=6{\frac {kT}{Fw}}[\coth({\frac {Fw}{2kT}})-2{\frac {kT}{Fw}}]}$

5

Для эффективной работы значение толщины канала w значительно превышает . В этом случае член в скобках приближается к единице. Поэтому уравнение 5 можно аппроксимировать как:${\displaystyle \ell }$

${\displaystyle R=6\lambda =6{\frac {kT}{Fw}}}$

6

Таким образом, t _r примерно пропорционально F. Разделение полос частиц X и Y, представленное конечным приращением ∆t _r их времен удерживания, достигается только в том случае, если приращение силы ∆F между ними достаточно. Для этого требуется разность сил всего в 10 ^{−16 Н.}

Величина F и ∆F зависят от свойств частиц, напряженности поля и типа поля. Это позволяет варьировать и адаптировать технику. Из этого базового принципа развились многие формы FFF, различающиеся по характеру применяемой разделительной силы и диапазону размеров молекул, на которые они нацелены.

В FFF отображение сигналов детектора как функции времени называется фрактограммой, в отличие от хроматограммы методов колоночной хроматографии. Фрактограмма может быть преобразована в график распределения одного или нескольких физических свойств аналита с использованием теории FFF и/или сигналов детектора. Это может быть размер, молярная масса, заряд и т. д.

Часто эти вещества представляют собой частицы, изначально взвешенные в небольшом объеме жидкого буфера и проталкиваемые буфером по каналу FFF. Различная скорость определенного вида частиц может быть обусловлена ​​его размером, массой и/или расстоянием от стенок канала с неравномерной скоростью потока. Таким образом, присутствие различных видов в образце может быть идентифицировано путем обнаружения общего свойства на некотором расстоянии вниз по длинному каналу и с помощью полученной фрактограммы, указывающей на присутствие различных видов пиками из-за различного времени прибытия, характерного для каждого вида, и его физических и химических свойств.

Большинство доступных сегодня методов представляют собой усовершенствованные версии методов, изначально созданных профессором Гиддингсом почти 4 десятилетия назад.

Из этих методов FFF flow был первым, предложенным на коммерческой основе. FFF flow разделяет частицы по размеру, независимо от плотности, и может измерять макромолекулы в диапазоне от 1 нм до 1 мкм. В этом отношении это наиболее универсальная из имеющихся субтехник FFF. Поперечный поток в FFF flow входит через пористую фритту в верхней части канала, выходя через полупроницаемую мембранную выходную фритту на накопительной стенке (т. е. нижней стенке). Симметричный поток был заменен асимметричным потоком в последние два десятилетия.

Потоковый FFF с полыми волокнами (HF5) был разработан Ли и др . (1974). ^[14] HF5 применялся для анализа белков и других макромолекул. HF5 был первой формой поточного FFF, разработанной в 1974 году. Преимущество заключается в том, что HF5 предлагает одноразовый канальный блок, который можно легко заменить в обычных приложениях. Одним из недостатков HF5 является ограниченный выбор мембранных материалов; доступны только мембраны из полиэфирсульфона (ПЭС). В настоящее время HF5 не получил широкого распространения из-за отсутствия гибкости и ограничений по загрузке образца.

Асимметричный поток FFF ( AF4 ), с другой стороны, имеет только одну полупроницаемую мембрану на нижней стенке канала. Таким образом, поперечный поток создается жидкостью-носителем, выходящей из нижней части канала. Это обеспечивает чрезвычайно мягкое разделение и «сверхширокий» диапазон разделения. Большинство используемых инструментов FFF представляют собой системы AF4. Основные области применения — фармацевтические исследования и разработки для белков, вирусов и вирусоподобных частиц, а также липосом. AF4 можно применять в водных и органических растворителях, поэтому с помощью этой техники можно разделять также органические полимеры.

Высокотемпературное асимметричное фракционирование в полевом потоке применяется для разделения полимеров с высокой и сверхвысокой молекулярной массой, растворимых при температурах выше 150 °C.

Термический FFF, как следует из названия, устанавливает разделительную силу путем приложения градиента температуры к каналу. Верхняя стенка канала нагревается, а нижняя стенка охлаждается, перемещая полимеры и частицы к холодной стенке посредством термической диффузии. Термический FFF был разработан как метод разделения синтетических полимеров в органических растворителях. Термический FFF уникален среди методов FFF тем, что он может разделять макромолекулы как по молярной массе, так и по химическому составу, что позволяет разделять фракции полимеров с одинаковой молекулярной массой. Сегодня этот метод идеально подходит для характеристики полимеров, гелей и наночастиц.

Одним из основных преимуществ термического FFF являются простые и очень хорошо определенные размеры разделительного канала, что делает возможной универсальную калибровку между лабораториями или приборами, поскольку константы калибровки термического FFF точно описывают отношение обычного (молекулярного) коэффициента диффузии D к коэффициенту термической диффузии (или термофоретической подвижности) D _T , которые зависят только от полимера. Таким образом, универсальная калибровка ThFFF является переносимой между приборами и лабораториями, в то время как хорошо известная универсальная калибровка эксклюзионной хроматографии является переносимой между полимерами только на том же приборе. ^[15]

Разделение потока в тонких ячейках (SPLITT) ^[16] — это специальная препаративная методика FFF, использующая гравитацию ^[17] или электричество ^[18] или диффузионные различия для разделения частиц размером более мкм на непрерывной основе. Система SPLITT имеет два входа и два выхода. Она выполняется путем закачки образца, погруженного в жидкость, в одно входное отверстие в начале канала при низкой скорости потока, при одновременной закачке жидкости-носителя во второе входное отверстие при гораздо более высокой скорости потока. Управляя соотношениями скоростей потока двух входных потоков и двух выходных потоков, можно контролировать разделение, и компоненты образца разделяются на две фракции разного размера. Использование только силы тяжести в качестве разделяющей силы делает SPLITT наименее чувствительной методикой FFF, ограниченной частицами размером более 1 мкм.

В центробежном FFF разделительное поле создается с помощью центробежной силы. Канал имеет форму кольца, которое вращается со скоростью вращения, которую можно запрограммировать во время работы. Поток и образец закачиваются в канал и центрифугируются, что позволяет оператору разделять частицы по массе (размеру и плотности). Преимущество центробежного FFF заключается в высоком разрешении по размеру, которое может быть достигнуто путем изменения приложенной силы, поскольку размер частиц пропорционален массе частиц в третьей степени.

Уникальное преимущество центробежного FFF заключается в возможности техники для высокого разрешения при достаточной плавучей плотности. Это позволяет разделять частицы с разницей в размере всего в 5%.

Центробежный FFF имеет преимущество в том, что частицы и макромолекулы могут быть разделены по плотности частиц, а не только по размеру частиц. В этом случае две одинаковые по размеру золотые и серебряные наночастицы могут быть разделены на два пика, в соответствии с разницей в плотности золотых и серебряных наночастиц,

В разделениях AF4 отношение массы ко времени составляет 1:1. С добавлением третьего параметра плотности к центробежному FFF это дает отношение, более похожее на отношение массы ко времени в степени три. Это приводит к значительно большему различию между пиками и значительно улучшает разрешение. Это может быть особенно полезно для новых продуктов, таких как композитные материалы и покрытые полимеры, содержащие наночастицы, т. е. частицы, которые могут не различаться по размеру, но различаются по плотности. Таким образом, две частицы одинакового размера все еще могут быть разделены на два пика, при условии, что плотность различна.

Ограничение метода заключается в нижнем пределе размера, который зависит от плотности образца. В частности, для биологических образцов предел составляет порядка 20–50 нм в диаметре.

В электрическом FFF применяется поперечный электрический ток (DC), который создает электрическое поле. В зависимости от заряда компонентов образца индуцируется скорость электрофоретического дрейфа, которой противодействует диффузия из броуновского движения, поэтому разделение зависит от соотношения электрофоретической подвижности и размера. Применение электрического FFF было ограничено и в настоящее время используется редко. Были разработаны другие модификации, а именно циклический электрический FFF, где применяется специальный переменный ток. Он позволяет разделять в соответствии с электрофоретической подвижностью. Другой разновидностью является электрический асимметричный поток FFF (EAF4), где электрическое поле применяется в дополнение к полю поперечного потока. EAF4 преодолевает ограничение чистого электрического FFF, который имеет плохое разрешение и страдает от продуктов электролиза и пузырьков, загрязняющих выходной канал и ухудшающих сигналы детектора. ^[19]

• Рода, А. (2005). «На пути к многоаналитным иммуноанализам: проточный твердофазный формат с хемилюминесцентным обнаружением». Клиническая химия . 51 (10): 1993– 1995. doi : 10.1373/clinchem.2005.053108 . ISSN  0009-9147. PMID  16299900.