Эритронолидсинтаза
эритронолидсинтаза
Идентификаторы
Номер ЕС2.3.1.94
Номер CAS87683-77-0
Базы данных
ИнтЭнзIntEnz вид
БРЕНДАзапись BRENDA
ExPASyNiceZyme вид
КЕГГзапись KEGG
МетаЦикметаболический путь
ПРИАМпрофиль
Структуры PDBRCSB PDB PDBe PDBsum
Генная онтологияAmiGO / QuickGO
Поиск
ЧВКстатьи
PubMedстатьи
NCBIбелки

В энзимологии эритронолидсинтаза (также 6-дезоксиэритронолид В-синтаза или ДЭБС ) — это фермент , катализирующий химическую реакцию

6 малонил-КоА + пропаноил-КоА 7 КоА + 6-дезоксиэритронолид B ⇌ {\displaystyle \rightleftharpoons}

Таким образом, двумя субстратами этого фермента являются малонил-КоА и пропаноил-КоА , тогда как его двумя продуктами являются КоА и 6-дезоксиэритронолид b. Этот фермент участвует в биосинтезе 12-, 14- и 16-членных макролидов.

Этот фермент принадлежит к семейству трансфераз , он был идентифицирован как часть модуля поликетидсинтазы типа 1. DEBS обнаружен в Saccharopolyspora erythraea и других актинобактериях и отвечает за синтез макролидного кольца , которое является предшественником антибиотика эритромицина . На сегодняшний день идентифицировано три категории поликетидсинтаз: тип 1, 2 и 3. Синтазы типа 1 включают большие многодоменные белки, содержащие все сайты, необходимые для синтеза поликетида . Синтазы типа 2 содержат активные сайты, распределенные между несколькими более мелкими полипептидами , а синтазы типа 3 представляют собой большие многобелковые комплексы, содержащие модули, которые имеют один активный сайт для каждого этапа синтеза поликетида. В случае DEBS существует три больших многофункциональных белка, DEBS 1, 2 и 3, каждый из которых существует в виде димера из двух модулей. Каждый модуль состоит как минимум из кетосинтазы (KS), сайта ацилпереносящего белка (ACP) и ацилтрансферазы (AT), но может также содержать кеторедуктазу (KR), дегидротазу (DH) и енолредуктазу (ER) для дополнительных реакций восстановления . Комплекс DEBS также содержит загрузочный домен на модуле 1, состоящий из ацилпереносящего белка и ацилтрансферазы. Конечная тиоэстераза действует исключительно для прекращения синтеза поликетида DEBS и циклизации макролидного кольца. [1] [2] [3]

Компоненты и функции модуля

Основные компоненты

Кетосинтаза

Активный центр этого фермента имеет очень широкую специфичность , что позволяет синтезировать длинные цепи атомов углерода путем присоединения через тиоэфирную связь небольших органических кислот, таких как уксусная и малоновая кислота . [4] Домен KS получает растущую поликетидную цепь из вышестоящего модуля и впоследствии катализирует образование связи CC между этим субстратом и связанным с ACP удлинителем, который выбирается доменом AT. [5]

Ацилтрансфераза

Каждый домен AT имеет α-карбоксилированный тиоэфир CoA (т. е. метилмалонил-CoA). Эта специфичность предотвращает необязательное добавление ферментов в модуль. AT захватывает нуклеофильную удлиняющую единицу β-карбоксиацил-CoA и переносит ее на плечо фосфопантетеина домена ACP. [6]

Функции посредством катализа ацильного переноса от метилмалонил-КоА к домену ACP в пределах того же модуля через ковалентный ацил-AT промежуточный продукт. Важность AT для строгого включения специфического удлинителя в синтез поликетидных строительных блоков делает жизненно важным, чтобы механизм и структура этих доменов были хорошо выяснены для разработки эффективных стратегий для региоспецифической инженерии включения удлинителя в биосинтез поликетида . [5]

Белок-переносчик ацилов

ACP не является субстрат-специфичным, что позволяет взаимодействовать с каждым доменом, присутствующим в его модуле. Этот белок сотрудничает с доменом кетосинтазы (KS) того же модуля для катализа удлинения поликетидной цепи, а затем взаимодействует с доменом KS следующего модуля для облегчения прямого переноса цепи . [7] ACP сначала принимает удлиняющую единицу от AT, затем сотрудничает с доменом KS в удлинении цепи и, наконец, закрепляет новую удлиненную цепь, поскольку она подвергается модификации в положении β-кето. Для выполнения своей функции домены ACP требуют посттрансляционного добавления группы фосфопантетеина к консервативному остатку серина ACP. Концевая сульфгидрильная группа фосфопантетеина является местом прикрепления растущей цепи поликетида. [8]

Тиоэстераза

Расположен на С-концевом участке самого дальнего нижележащего модуля. Он заканчивается тиоэстеразой, которая высвобождает зрелый поликетид (либо в виде свободной кислоты, либо циклизованного продукта) посредством лактонизации. [9]

Примечание: Как указано выше, первый модуль DEBS содержит дополнительную ацилтрансферазу и ACP для инициирования реакций.

Необязательные компоненты

Дополнительные компоненты могут включать в себя один или несколько из следующих компонентов:

Кеторедуктаза — использует НАДФН для стереоспецифического восстановления его до гидроксильной группы [10]

Дегидратаза — катализирует удаление гидроксильной группы для создания двойной связи из органических соединений в форме воды.

Энолредуктаза — использует НАДФН для восстановления двойной связи органического соединения.

Сравнение синтеза жирных кислот и синтеза поликетидов

Синтез жирных кислот у большинства прокариот происходит посредством синтазы II типа, состоящей из множества ферментов, расположенных в цитоплазме , которые можно разделить. Однако некоторые бактерии, такие как Mycobacterium smegmatis , а также млекопитающие и дрожжи используют синтазу I типа, которая представляет собой большой многофункциональный белок, аналогичный синтазе, используемой для синтеза поликетидов. Эта синтаза I типа включает дискретные домены, на которых катализируются отдельные реакции.

В синтезе жирных кислот и поликетидном синтезе промежуточные продукты ковалентно связаны с ACP или ацил-переносчиком белка. Однако в синтезе жирных кислот исходными молекулами являются ацил-КоА или малонил-КоА, но поликетидсинтазы могут использовать несколько праймеров, включая ацетил-КоА , пропионил-КоА , изобутирил-КоА, циклогексаноил-КоА, 3-амино-5-гидроксибензоил-КоА или циннамил-КоА. В синтезе жирных кислот и поликетидном синтезе эти носители КоА будут заменены на ACP, прежде чем они будут включены в растущую молекулу.

На этапах удлинения синтеза жирных кислот кетосинтаза, кеторедуктаза, дегидратаза и еноилредуктаза используются последовательно для создания насыщенной жирной кислоты, затем может быть выполнена постсинтетическая модификация для создания ненасыщенной или цикложирной кислоты. Однако в синтезе поликетидов эти ферменты могут использоваться в различных комбинациях для создания сегментов поликетида, которые являются насыщенными, ненасыщенными или имеют гидроксильную или карбонильную функциональную группу. Существуют также ферменты, используемые как в синтезе жирных кислот, так и в синтезе поликетидов, которые могут вносить изменения в молекулу после ее синтеза.

Что касается регулирования длины синтезируемой молекулы, то конкретный механизм, посредством которого регулируется длина цепи жирной кислоты, остается неизвестным, но ожидается, что связанные с АЦП цепи жирной кислоты правильной длины действуют как аллостерические ингибиторы ферментов синтеза жирных кислот. В синтезе поликетидов синтазы состоят из модулей, в которых порядок ферментативных реакций определяется структурой белкового комплекса . Это означает, что как только молекула достигает последней реакции последнего модуля, поликетид высвобождается из комплекса ферментом тиоэстеразой. Следовательно, регуляция длины цепи жирной кислоты, скорее всего, обусловлена ​​аллостерической регуляцией , а регуляция длины поликетида обусловлена ​​специфическим ферментом в составе поликетидсинтазы. [11]

Приложение

Начиная с конца 1980-х и начала 1990-х годов, когда проводились исследования поликетидсинтаз (ПКС), был разработан и объяснен ряд стратегий генетической модификации таких ПКС. [12] Такие изменения в ПКС представляют особый интерес для фармацевтической промышленности , поскольку новые соединения с антибиотическим или другим антимикробным действием обычно синтезируются после внесения изменений в структуру ПКС. Инженерия комплекса ПКС является гораздо более практичным методом, чем синтез каждого продукта посредством химических реакций in vitro из-за стоимости реагентов и количества реакций, которые должны иметь место. Просто для того, чтобы проиллюстрировать потенциальные выгоды от синтеза новых и эффективных антимикробных препаратов, в 1995 году мировые продажи эритромицина и его производных превысили 3,5 миллиарда долларов. [13] В этой части будут рассмотрены модификации структуры в DEBS PKS для создания новых продуктов в отношении производных эритромицина, а также совершенно новых поликетидов, полученных с помощью различных средств проектирования модульного комплекса.

Существует пять основных методов, с помощью которых DEBS регулярно модифицируется:

  • Удаление или деактивация активных сайтов и модулей
  • Замена или добавление активных сайтов и модулей
  • Биосинтез, направленный на предшественников
  • Замена KR для измененной стереоспецифичности
  • Адаптация модификаций ферментов

Удаление или деактивация активных сайтов и модулей

Первый зарегистрированный случай генной инженерии DEBS произошел в 1991 году группой Катца [14] , которая удалила активность KR в модуле 5 DEBS, что привело к образованию 5-кетомакролида вместо обычного 5-гидроксимакролида. С тех пор были созданы делеции или инактивации (часто путем введения точечных мутаций) многих активных участков для пропуска реакций восстановления и/или дегидратации . Такие модификации нацелены на различные активные участки KR, DH, ER, которые можно увидеть на разных модулях DEBS. Фактически, можно удалить целые модули, чтобы уменьшить длину цепи поликетидов и изменить цикл восстановления/дегидратации, который обычно наблюдается. [13]

Замена или добавление активных сайтов и модулей

В одной из первых реорганизаций DEBS копия терминального TE была помещена в конец каждого модуля в отдельных испытаниях, что, как и предсказывалось, привело к расщеплению и высвобождению соответственно укороченных продуктов. [14] После этого были разработаны еще более сложные методы для добавления или замены одного или нескольких активных участков в комплекс DEBS.

Наиболее распространенным методом конструирования DEBS по состоянию на 2005 год является замена AT, при которой нативный домен AT заменяется на AT, специфичный для другого праймера или молекулы-удлинителя. [12] При нормальных обстоятельствах DEBS имеет «загрузочный» или праймирующий AT, специфичный преимущественно для пропионил-КоА, в то время как все шесть последующих AT специфичны для молекулы-удлинителя, метилмалонил-КоА. Все нативные AT DEBS были успешно заменены на AT из других модульных PKS, таких как PKS, который производит рапамицин; который заменяет метилмалонил-КоА-специфичный AT на малонил-КоА AT и производит неметилированное производное эритромицина. [12] Этот способ конструирования, в частности, показывает универсальность, которая может быть достигнута, поскольку как праймирующая молекула, так и молекула-удлинитель могут быть изменены для получения множества новых продуктов. В дополнение к сайтам AT, любой из активных участков восстановительного/дегидратирующего фермента может быть заменен одним или несколькими дополнительными активными участками восстановительного/дегидратирующего фермента. Например, в одном исследовании KR модуля 2 DEBS был заменен полным набором восстановительных доменов (DH, ER и KR), полученных из модуля 1 рапамицинового PKS, как показано на рисунке 2 РИСУНОК 2


Существует по крайней мере один отчет о замене целого модуля, в котором модуль 2 DEBS был заменен модулем 5 рапамицинового PKS [ 15]. Активность двух модулей идентична, и тот же предшественник эритромицина (6-дезоксиэритронолид B) был произведен химерным PKS; однако, это показывает возможность создания PKS с модулями из двух или даже нескольких различных PKS с целью получения множества новых продуктов. Однако существует одна проблема с соединением гетерологичных модулей; есть недавние доказательства того, что аминокислотная последовательность между доменом ACP и последующим доменом KS нижестоящих модулей играет важную роль в переносе растущего поликетида из одного модуля в другой. [15] Эти области были обозначены как «линкеры», и хотя они не имеют прямой каталитической роли, любая замена линкерной области, которая структурно не совместима с PKS дикого типа, может привести к плохим выходам ожидаемого продукта.

Биосинтез, направленный на предшественников

Используя полусинтетический подход, дикетидный промежуточный продукт может быть добавлен либо in vitro, либо in vivo к комплексу DEBS, в котором активность первого KS была удалена. [14] Это означает, что дикетид будет загружен на второй KS (в модуле 2 DEBS) и будет обработан до конца, как обычно. Было показано, что этот второй KS довольно неспецифичен, и большое количество синтетических дикетидов может быть принято и впоследствии полностью удлинено и высвобождено. Однако также было замечено, что этот KS не очень толерантен к структурным изменениям в положениях C2 и C3, особенно если стереохимия изменена . [14] На сегодняшний день это был наиболее успешный подход к созданию макролидов с эффективностью, равной или большей, чем у эритромицина. [16]

Замена кеторедуктазы для изменения стереоспецифичности

В модульном PKS активные участки KR катализируют стереоспецифическое восстановление поликетидов. Инверсия спиртового стереоцентра в противоположный стереоизомер возможна путем замены дикого типа KR на KR противоположной специфичности. [13] Это редко удавалось сделать успешно, и только на терминальном KR комплекса DEBS. Было высказано предположение, что изменение стереоспецифичности KR в более раннем модуле также потребует одновременной модификации всех нижестоящих KS. [12]

Недавние исследования аминокислотной последовательности двух типов стереоспецифичности в KR определили идеальную корреляцию с этими остатками и предсказанным стереохимическим результатом. [12] Это особенно полезно в ситуациях, когда последовательность гена модульного PKS известна, но конечная структура продукта еще не выяснена.

Адаптация модификаций ферментов

Ферменты, которые действуют на макролид после того, как он был высвобожден и циклизован DEBS, называются ферментами адаптации. Многие такие ферменты участвуют в производстве эритромицина из конечного продукта немодифицированного DEBS, 6-дезоксиэритронолида B. Такие классы ферментов включают в основном оксидоредуктазы и гликозилтрансферазы и необходимы для антибиотической активности эритромицина. [12] [14] [17]

До сих пор было сделано мало попыток изменить пути адаптации, однако ферменты, которые участвуют в таких путях, в настоящее время характеризуются и представляют большой интерес. Исследования облегчаются тем, что их соответствующие гены расположены рядом с генами PKS, и поэтому многие из них легко идентифицируются. [17] Нет сомнений, что в будущем изменение ферментов адаптации может привести к появлению множества новых и эффективных антимикробных препаратов.

Структурные исследования

По состоянию на конец 2007 года для этого класса ферментов было решено 8 структур с кодами доступа PDB 1KEZ, 1MO2, 1PZQ, 1PZR, 2HG4, 2JU1, 2JU2 и 2QO3.

Другие названия этого класса ферментов — малонил-КоА:пропаноил-КоА малонилтрансфераза (циклизирующая). Другие общеупотребительные названия включают фермент конденсации эритронолида и малонил-КоА:пропионил-КоА малонилтрансфераза (циклизирующая).

Ссылки

  1. ^ Khosla C, Tang Y, Chen AY, Schnarr NA, Cane DE (2007). «Структура и механизм действия 6-дезоксиэритронолид B-синтазы». Annual Review of Biochemistry . 76 : 195–221. doi :10.1146/annurev.biochem.76.053105.093515. PMID  17328673.
  2. ^ Staunton J, Weissman KJ (август 2001 г.). «Биосинтез поликетидов: обзор тысячелетия». Natural Product Reports . 18 (4): 380–416. doi :10.1039/a909079g. PMID  11548049.
  3. ^ Katz L (2009). "Глава 6. Парадигма DEBS для модульных поликетидсинтаз типа I и далее". Комплексные ферменты в микробном биосинтезе природных продуктов, часть B: поликетиды, аминокумарины и углеводы . Методы в энзимологии. Том 459. стр. 113–42. doi :10.1016/S0076-6879(09)04606-0. ISBN 978-0-12-374591-0. PMID  19362638.
  4. ^ Hopwood DA (февраль 2004 г.). «Взлом поликетидного кода». PLOS Biology . 2 (2): E35. doi : 10.1371 /journal.pbio.0020035 . PMC 340943. PMID  14966534. 
  5. ^ ab Wong FT, Chen AY, Cane DE, Khosla C (январь 2010 г.). «Распознавание белок-белок между ацилтрансферазами и ацилпереносящими белками в многомодульных поликетидсинтазах». Биохимия . 49 (1): 95–102. doi :10.1021/bi901826g. PMC 2805051. PMID  19921859 . 
  6. ^ Chen AY, Schnarr NA, Kim CY, Cane DE, Khosla C (март 2006 г.). «Специфичность удлинительного блока и ацилпереносящего белка доменов кетосинтазы 6-дезоксиэритронолид B-синтазы». Журнал Американского химического общества . 128 (9): 3067–74. doi :10.1021/ja058093d. PMC 2532788. PMID  16506788 . 
  7. ^ Kapur S, Chen AY, Cane DE, Khosla C (декабрь 2010 г.). «Молекулярное распознавание между доменами кетосинтазы и ацилпереносящего белка 6-дезоксиэритронолид B-синтазы». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 107 (51): 22066–71. Bibcode : 2010PNAS..10722066K. doi : 10.1073/pnas.1014081107 . PMC 3009775. PMID  21127271 . 
  8. ^ Алексеев В.Ю., Лю Ч.В., Кейн Д.Е., Пуглиси Дж.Д., Хосла К. (октябрь 2007 г.). «Структура раствора и предложенный интерфейс распознавания домена домена ацилпереносящего белка из модульной поликетидсинтазы». Protein Science . 16 (10): 2093–107. doi :10.1110/ps.073011407. PMC 2204127 . PMID  17893358. 
  9. ^ Tsai SC, Miercke LJ, Krucinski J, Gokhale R, Chen JC, Foster PG и др. (декабрь 2001 г.). «Кристаллическая структура домена тиоэстеразы, образующего макроцикл, поликетидсинтазы эритромицина: универсальность из уникального субстратного канала». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 98 (26): 14808–13. Bibcode : 2001PNAS ...9814808T. doi : 10.1073/pnas.011399198 . PMC 64940. PMID  11752428. 
  10. ^ Keatinge-Clay AT, Stroud RM (апрель 2006 г.). «Структура кеторедуктазы определяет организацию ферментов обработки бета-углерода модульных поликетидсинтаз». Структура . 14 (4): 737–48. doi : 10.1016/j.str.2006.01.009 . PMID  16564177.
  11. ^ Крик Д. (21 февраля 2011 г.). Бактериальный метаболизм жирных кислот и поликетидов. Лекция MIP 443 (отчет). Форт-Коллинз, Колорадо: Кафедра микробиологии, иммунологии, патологии. Университет штата Колорадо.
  12. ^ abcdef McDaniel R, Welch M, Hutchinson CR (февраль 2005 г.). «Генетические подходы к поликетидным антибиотикам. 1». Chemical Reviews . 105 (2): 543–58. doi :10.1021/cr0301189. PMID  15700956.
  13. ^ abc McDaniel R, Thamchaipenet A, Gustafsson C, Fu H, Betlach M, Ashley G (март 1999). «Множественные генетические модификации поликетидсинтазы эритромицина для получения библиотеки новых «неестественных» натуральных продуктов». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 96 (5): 1846–51. Bibcode :1999PNAS...96.1846M. doi : 10.1073/pnas.96.5.1846 . PMC 26699 . PMID  10051557. 
  14. ^ abcde Staunton J (июнь 1998). "Комбинаторный биосинтез эритромицина и сложных поликетидов". Current Opinion in Chemical Biology . 2 (3): 339–45. doi :10.1016/s1367-5931(98)80007-0. PMID  9691072.
  15. ^ ab Gokhale RS, Tsuji SY, Cane DE, Khosla C (апрель 1999). "Диссектинг и эксплуатация межмодульной связи в поликетидсинтазах". Science . 284 (5413): 482–5. Bibcode :1999Sci...284..482G. doi :10.1126/science.284.5413.482. PMID  10205055.
  16. ^ Hutchinson CR, McDaniel R (декабрь 2001 г.). «Комбинаторный биосинтез в микроорганизмах как путь к новым антимикробным, противоопухолевым и нейрорегенеративным препаратам». Current Opinion in Investigational Drugs . 2 (12): 1681–90. PMID  11892929.
  17. ^ ab Rix U, Fischer C, Remsing LL, Rohr J (октябрь 2002 г.). «Модификация шагов адаптации после ПКС посредством комбинаторного биосинтеза». Natural Product Reports . 19 (5): 542–80. doi :10.1039/b103920m. PMID  12430723.

Дальнейшее чтение

  • Омура С., Накагава А. (1981). «Биосинтез 16-членных макролидных антибиотиков». Биосинтез . Т. 4. С. 175–192. doi :10.1007/978-3-642-67724-3_8. ISBN 978-3-642-67726-7. {{cite book}}: |journal=проигнорировано ( помощь )
  • Робертс Г., Лидли П.Ф. (1984). «Использование [3H]тетрагидроцеруленина для анализа конденсирующей ферментной активности в Streptomyces erythreus». Biochem. Soc. Trans . 12 (4): 642–643. doi :10.1042/bst0120642.
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Эритронолид_синтаза&oldid=1236210522"