Восточный блот
Биохимическая техника

Восточный блоттинг , или восточный блоттинг , — это биохимический метод, используемый для анализа посттрансляционных модификаций белков , включая добавление липидов, фосфатов и гликоконъюгатов. Чаще всего он используется для обнаружения углеводных эпитопов . Таким образом, восточный блоттинг можно считать расширением биохимического метода вестерн-блоттинга . Термином «восточный блоттинг» описывается множество методов, большинство из которых используют фосфопротеин , блоттингованный из геля электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) на поливинилиденфторидной или нитроцеллюлозной мембране. Перенесенные белки анализируются на посттрансляционные модификации с использованием зондов, которые могут обнаруживать липиды , углеводы , фосфорилирование или любые другие модификации белков. Восточный блоттинг следует использовать для обозначения методов, которые обнаруживают их мишени посредством специфического взаимодействия посттрансляционных модификаций и зонда, что отличает их от стандартного дальне-вестерн-блоттинга . В принципе, метод восточного блоттинга аналогичен методу лектинового блоттинга (т.е. обнаружению углеводных эпитопов на белках или липидах). [1]

История и множественные определения

Определение термина «восточный блот» несколько запутано из-за того, что несколько групп авторов называют новый метод « восточным блоттом » или его производным. Все определения являются производными от метода вестерн-блота , разработанного Тоубином в 1979 году. [2] Текущие определения суммированы ниже в порядке первого использования названия; однако все они основаны на некоторых более ранних работах. В некоторых случаях метод практиковался в течение некоторого времени до введения термина.

  • (1982) Термин «восточный блоттинг» был специально отвергнут двумя отдельными группами: Рейнхарт и Маламуд называли белковый блоттинг нативного геля нативным блотом ; [3] Пефероен и др. решили назвать свой метод нанесения белков, разделенных гелем додецилсульфата натрия, на нитроцеллюлозу с использованием вакуума вакуумным блоттингом . [4] [5]
  • (1984) Ближневосточный блоттинг был описан как блот полиА РНК (разделенной агарозой), которая затем иммобилизуется. Иммобилизованная РНК затем исследуется с помощью ДНК. [6]
  • (1996) Восточно-вестерн-блот впервые был использован Богдановым и др. [7] Метод включал блоттинг фосфолипидов на поливинилиденфториде или нитроцеллюлозной мембране перед переносом белков на ту же нитроцеллюлозную мембрану с помощью обычного вестерн-блоттинга и зондирования с помощью специфических антител к конформации. Этот метод основан на более ранней работе Таки и др. в 1994 году, которую они первоначально назвали ТСХ-блоттингом , [8] и был основан на похожем методе, представленном Тоубином в 1984 году. [9]
  • (2000) Дальневосточный блоттинг , по-видимому, был впервые назван в 2000 году Ишикавой и Таки. [10] Метод более подробно описан в статье о дальневосточном блоттинге , но основан на окрашивании антителами или лектином липидов, перенесенных на поливинилиденфторидные мембраны.
  • (2001) Восточный блоттинг был описан как метод обнаружения гликоконъюгатов, полученных путем блоттинга BSA на поливинилиденфторидных мембранах с последующей обработкой периодатом. Окисленный белок затем обрабатывается сложной смесью, генерируя новый конъюгат на мембране. Затем мембрану зондируют антителами на наличие интересующих эпитопов. [11] Этот метод также обсуждался в более поздних работах той же группы. [12] [13] По сути, этот метод представляет собой дальневосточный блоттинг. [14]
  • (2002) Восточный блоттинг также использовался для описания иммуноблоттинга, проводимого на белках, нанесенных на поливинилиденфторидную мембрану из ПААГ-геля с противоположной полярностью. [15] Поскольку это по сути вестерн-блоттинг , обращение заряда было использовано для того, чтобы окрестить этот метод восточным блоттингом . [16] [17]
  • (2005) Истерн-блот использовался для описания блота белков на поливинилиденфторидной мембране, где зондом является аптамер, а не антитело. [18] Это можно рассматривать как нечто похожее на Саузерн-блот , однако взаимодействие происходит между молекулой ДНК (аптамер) и белком, а не двумя молекулами ДНК. [19] Метод похож на юго-западный блот .
  • (2006) Восточный блоттинг использовался для обозначения обнаружения белков слияния посредством комплементации. Название основано на использовании активатора фермента (EA) как части обнаружения. [20] [21] [22]
  • (2009) Истерн-блоттинг был недавно переименован Томасом и др. в метод, который исследует белки, нанесенные на поливинилиденфторидную мембрану с лектинами, холерным токсином и химическими красителями, для обнаружения гликозилированных, липоилированных или фосфорилированных белков. [14] Эти авторы отличают метод от дальневосточного блоттинга, названного Таки и др. [10], тем, что они используют лектиновые зонды и другие окрашивающие реагенты.
  • (2009) Истерн-блот использовался для описания блота белков на нитроцеллюлозной мембране, где зондом является аптамер, а не антитело. [23] Метод похож на юго-западный блоттинг.
  • (2011) В недавнем исследовании термин «восточный блоттинг» использовался для описания обнаружения гликопротеинов с помощью лектинов, таких как конканавалин А [24]

Очевидно, что единого общепринятого определения этого термина не существует. В недавней статье [25] было взято интервью у Эда Саузерна , создателя Саузерн-блота , относительно переименования восточного блоттинга Танакой и др. [12] Статья сравнивает восточный блоттинг с «феями, единорогами и бесплатным обедом» и утверждает, что восточных блоттингов «не существует». Восточный блоттинг упоминается в учебнике по иммунологии, в котором сравниваются распространенные методы блоттинга (саузерн-, северн- и западн-), и утверждается, что «восточный блоттинг, однако, существует только в тестовых вопросах». [26]

Принципы, используемые для восточного блоттинга для обнаружения гликанов, можно проследить до использования лектинов для обнаружения гликозилирования белков . Самый ранний пример этого способа обнаружения — Таннер и Ансти в 1976 году, где лектины использовались для обнаружения гликозилированных белков, выделенных из человеческих эритроцитов . [27] Специфическое обнаружение гликозилирования с помощью блоттинга обычно называют лектиновым блоттингом . Краткое изложение более поздних улучшений протокола было предоставлено Х. Фризом. [1]

Приложения

Одно из применений метода включает обнаружение модификаций белков у двух видов бактерий Ehrlichia - E. muris и IOE. Для обнаружения модификаций белков использовались субъединица холерного токсина B (связывающаяся с ганглиозидами ), конканавалин A (определяющий содержащие маннозу гликаны) и нитрофосфомолибдат-метиловый зеленый (определяющий фосфопротеины). Метод показал, что антигенные белки невирулентного E.muris более посттрансляционно модифицированы, чем высоковирулентный IOE. [14]

Значение

Большинство белков , которые транслируются с мРНК, подвергаются модификациям, прежде чем становятся функциональными в клетках. Эти модификации известны как посттрансляционные модификации . Зарождающиеся или свернутые белки, которые стабильны в физиологических условиях, затем подвергаются ряду специфических модификаций, катализируемых ферментами, на боковых цепях или остовах.

Посттрансляционная модификация белков может включать ацетилирование , ацилирование ( миристоилирование , пальмитоилирование ), алкилирование , аргинилирование , АДФ-рибозилирование , биотинилирование , формилирование , геранилгеранилирование , глутамилирование, гликозилирование , глицилирование, гидроксилирование , изопренилирование , липоилирование , метилирование , нитроалкилирование, фосфопантетеинилирование , фосфорилирование , пренилирование , селенирование , S -нитрозилирование , сукцинилирование , сульфатирование , трансглутамилирование , сульфинилирование, сульфонилирование и убиквитинирование (сумоилирование, неддилирование). [28] [29]

Посттрансляционные модификации, происходящие на N-конце аминокислотной цепи, играют важную роль в транслокации через биологические мембраны. К ним относятся секреторные белки прокариот и эукариот , а также белки, предназначенные для включения в различные клеточные и органелльные мембраны, такие как лизосомы , хлоропласты , митохондрии и плазматическая мембрана . Экспрессия посттранслированных белков важна при нескольких заболеваниях.

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ ab Freeze, HH (1993). «Подготовка и анализ гликоконъюгатов». Current Protocols in Molecular Biology . Глава 17: 17.7.1–17.7.8. doi :10.1002/0471142727.mb1707s23. PMID  18265163. S2CID  205153650.
  2. ^ Towbin; Staehelin, T; Gordon, J; et al. (1979). «Электрофоретический перенос белков из полиакриламидных гелей в нитроцеллюлозные листы: процедура и некоторые приложения». PNAS . 76 (9): 4350–4. Bibcode :1979PNAS...76.4350T. doi : 10.1073/pnas.76.9.4350 . PMC 411572 . PMID  388439. 
  3. ^ Рейнхарт и Маламуд; Маламуд, Д. (1982). «Перенос белка из изоэлектрических фокусирующих гелей: нативный блот». Аналитическая биохимия . 123 (2): 229–235. doi :10.1016/0003-2697(82)90439-0. PMID  6181706.
  4. ^ Peferoen; et al. (1982). «Вакуумный блоттинг: новый простой и эффективный перенос белков из гелей додецилсульфата натрия-полиакриламида в нитроцеллюлозу». FEBS Letters . 145 (2): 369–372. Bibcode : 1982FEBSL.145..369P. doi : 10.1016/0014-5793(82)80202-0 . S2CID  85394990.
  5. ^ Рокко, Р. М., ред. (2005). Знаковые статьи по клинической химии . Elsevier Science. стр. 385. ISBN 978-0-444-51950-4.
  6. ^ Wreschner, DH; Herzberg, M. (1984). «Новая среда для блоттинга для простого выделения и идентификации высокоразрешенной информационной РНК». Nucleic Acids Research . 12 (3): 1349–1359. doi :10.1093/nar/12.3.1349. PMC 318581. PMID  6701087 . 
  7. ^ Богданов; Сан, Дж.; Кабак, Х. Р.; Доухан, В.; и др. (1996). «Фосфолипид действует как шаперон при сборке мембранного транспортного белка». Журнал биологической химии . 271 (20): 11615–11618. doi : 10.1074/jbc.271.20.11615 . PMID  8662750.
  8. ^ Таки; Ханда, С; Ишикава, Д; и др. (1994). «Блоттинг гликолипидов и фосфолипидов с высокоэффективной тонкослойной хроматограммы на поливинилидендифторидной мембране». Аналитическая биохимия . 221 (2): 312–316. doi :10.1006/abio.1994.1418. PMID  7810872.
  9. ^ Towbin; Schoenenberger, C; Ball, R; Braun, DG; Rosenfelder, G; et al. (1984). «Блоттинг гликосфинголипидов: иммунологическая процедура обнаружения после разделения тонкослойной хроматографией». Журнал иммунологических методов . 72 (2): 471–9. doi :10.1016/0022-1759(84)90015-2. PMID  6381603.
  10. ^ ab Ishikawa & Taki; Taki, T (2000). "Тонкослойная хроматография блоттинга с использованием поливинилидендифторидной мембраны (дальневосточный блоттинг) и ее применение". Метаболизм сфинголипидов и клеточная сигнализация, часть B. Методы в энзимологии. Т. 312. С. 145–57. doi :10.1016/S0076-6879(00)12905-2. ISBN 9780121822132. PMID  11070868.
  11. ^ Шан; Танака, Х; Шояма, И; и др. (2001). «Иммуноферментный анализ глицирризина с использованием моноклональных антител к глицирризину и новый восточный блоттинг для глюкуронидов глицирретиновой кислоты». Аналитическая химия . 73 (24): 5784–90. doi :10.1021/ac0106997. PMID  11791545.
  12. ^ ab Tanaka; Fukuda, N; Shoyama, Y; et al. (2007). «Восточный блоттинг и иммуноаффинная концентрация с использованием моноклональных антител для сапонинов женьшеня в области традиционной китайской медицины». Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии . 55 (10): 3783–7. doi :10.1021/jf063457m. PMID  17455950.
  13. ^ Фукуда; Шан, Шаоцзе; Танака, Хироюки; Сёяма, Юкихиро; и др. (2006). «Новая методология окрашивания: Истерн-блоттинг гликозидов в области лекарств Кампо». Журнал натуральных лекарств . 60 : 21–27. дои : 10.1007/s11418-005-0005-3. S2CID  44234050.
  14. ^ abc Thomas; Thirumalapura, N; Crossley, EC; Ismail, N; Walker, DH; et al. (2009). «Модификации антигенных белков у эрлихий». Parasite Immunology . 31 (6): 296–303. doi :10.1111/j.1365-3024.2009.01099.x. PMC 2731653. PMID  19493209 . 
  15. ^ Buxbaum; et al. (2002). «Катионный электрофорез и электроперенос мембранных гликопротеинов». Аналитическая биохимия . 314 (1): 70–76. doi :10.1016/S0003-2697(02)00639-5. PMID  12633604.
  16. ^ Куриен и Скофилд; Скофилд, Р. Х. (2006). «Вестерн-блоттинг». Методы . 38 (4): 283–293. doi :10.1016/j.ymeth.2005.11.007. PMID  16483794.
  17. ^ Buxbaum (2009). "Катионный электрофорез и Истерн-блоттинг". Белковый блоттинг и обнаружение . Методы в молекулярной биологии. Т. 536. С. 115–128. doi :10.1007/978-1-59745-542-8_14. ISBN 978-1-934115-73-2. PMID  19378051.
  18. ^ Leca-Bouvier & Blum; Blum, Loïc (2005). "Биосенсоры для обнаружения белков: обзор". Analytical Letters . 38 (10): 1491. doi :10.1081/AL-200065780. S2CID  94503772.
  19. ^ Jayasena (1999). «Аптамеры: новый класс молекул, которые конкурируют с антителами в диагностике». Клиническая химия . 45 (9): 1628–1650. doi : 10.1093/clinchem/45.9.1628 . PMID  10471678.
  20. ^ Хорецка; Чартер, Н.В.; Босано, Б.Л.; Фунг, П.; Кобель, П.; Пэн, К.; Эглен, Р.М.; и др. (2006). «Новый метод блоттинга белков без антител с использованием комплементации фрагментов ферментов». BioTechniques . 40 (3): 381–383. doi : 10.2144/000112119 . PMID  16568826.
  21. ^ Олсон и Эглен; Эглен, Р. М. (2007). «Комплементация бета-галактозидазы: платформа люминесцентного анализа на основе клеток для открытия лекарств». ASSAY and Drug Development Technologies . 5 (1): 137–144. doi :10.1089/adt.2006.052. PMID  17355206.
  22. ↑ Коммерчески доступные наборы для восточной блоттинга Архивировано 5 сентября 2009 г. на Wayback Machine
  23. ^ Лин и МакНэтти; Лин, Дж. С. (2009). «Регионально защищенная ПЦР на основе аптамеров для обнаружения белков». Клиническая химия . 55 (9): 1687–1693. doi : 10.1373/clinchem.2009.127266 . PMID  19589846.
  24. ^ Мариаппа Д., Сауэрт К., Мариньо К., Тернок Д., Вебстер Р., ван Аалтен Д.М., Фергюсон МА., Мюллер Х.А. Белок O-GlcNAcylation необходим для передачи сигнала фактора роста фибробластов в Drosophila. Sci Signal. 2011 г., 20 декабря; 4(204) ra89. http://davapc1.bioch.dundee.ac.uk/pdf/nesthocker.pdf
  25. ^ Восточное пятно на ландшафте
  26. ^ Латтман, Братке и Куппер (2006). Иммунология . Academic Press. стр. 11. ISBN 978-0-12-088544-2.
  27. ^ Таннер, М. Дж.; Ансти, Д. Дж. (1976). «Метод прямой демонстрации лектин-связывающих компонентов мембраны эритроцитов человека». Biochemical Journal . 153 (2): 265–270. doi :10.1042/bj1530265. PMC 1172571. PMID  1275889 . 
  28. ^ Манн, М; Дженсен, О.Н. (2003). «Протеомный анализ посттрансляционных модификаций». Nature Biotechnology . 21 (3): 255–261. doi :10.1038/nbt0303-255. PMID  12610572. S2CID  205266061.
  29. ^ Уолш, CT; Гарно-Цодикова, S ; Гатто, GJ Jr (2005). «Посттрансляционные модификации белков: химия диверсификаций протеома». Angewandte Chemie International Edition на английском языке . 44 (45): 7342–7372. doi :10.1002/anie.200501023. PMID  16267872. S2CID  32157563.
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Eastern_blot&oldid=1230318040"