Вытеснительная хроматография

Вытеснительная хроматография — это метод хроматографии , при котором образец помещается в головку колонки ^{[n 1]} и затем вытесняется растворенным веществом , которое сорбируется сильнее, чем компоненты исходной смеси. В результате компоненты разделяются на последовательные «прямоугольные» зоны высококонцентрированных чистых веществ, а не на разделенные растворителем «пики». ^[1] Это в первую очередь препаративный метод; по сравнению с другими режимами хроматографии можно получить более высокую концентрацию продукта, более высокую чистоту и повышенную пропускную способность.

Появление вытеснительной хроматографии можно приписать Арне Тиселиусу [ ^2], который в 1943 году впервые классифицировал режимы хроматографии как фронтальную, элюционную и вытеснительную. Вытеснительная хроматография нашла множество применений, включая изоляцию трансурановых элементов ^[3] и биохимических объектов. ^[4] Метод был переработан Чабой Хорватом ^[5] , который использовал современные колонки и оборудование высокого давления. С тех пор он нашел множество применений, особенно в области очистки биологических макромолекул.

Основной принцип вытеснительной хроматографии заключается в следующем: на матрице (стационарной фазе) имеется лишь конечное число мест связывания для растворенных веществ, и если место занято одной молекулой, оно недоступно для других. Как и в любой хроматографии, равновесие устанавливается между молекулами определенного вида, связанными с матрицей, и молекулами того же вида, свободными в растворе. Поскольку число мест связывания конечно, когда концентрация свободных молекул в растворе велика по сравнению с константой диссоциации для мест, эти места будут в основном заполнены. Это приводит к нисходящей кривизне на графике связанного и свободного растворенного вещества, в простейшем случае давая изотерму Ленгмюра . ^{[n 2]} Молекула с высоким сродством к матрице (вытеснитель) будет более эффективно конкурировать за места связывания, оставляя подвижную фазу обогащенной растворенным веществом с более низким сродством. Поток подвижной фазы через колонку преимущественно уносит растворенное вещество с меньшим сродством, и, таким образом, при высокой концентрации растворенное вещество с большим сродством в конечном итоге вытеснит все молекулы с меньшим сродством.

В начале цикла смесь разделяемых растворов подается в колонку в условиях, выбранных для обеспечения высокого удерживания. ^{[n 3]} Растворы с более высоким сродством предпочтительно удерживаются вблизи головки колонки, а растворы с более низким сродством перемещаются дальше вниз по потоку. Самый быстро движущийся компонент начинает образовывать чистую зону ниже по потоку. Другие компоненты также начинают образовывать зоны, но постоянная подача смешанного сырья в головку колонки препятствует полному разделению.

После загрузки всего образца подача переключается на вытеснитель, выбранный с более высоким сродством, чем любой компонент образца. ^{[n 4]} Вытеснитель образует зону с острым краем в верхней части колонки, выталкивая другие компоненты вниз по течению. Каждый компонент образца теперь действует как вытеснитель для растворенных веществ с более низким сродством, и растворенные вещества сортируются в ряд смежных полос («поезд смещения»), все двигаясь вниз по течению со скоростью, установленной вытеснителем. Размер и загрузка колонки выбираются таким образом, чтобы этот процесс сортировки достигал завершения до того, как компоненты достигнут дна колонки. Растворенные вещества появляются в нижней части колонки в виде ряда смежных зон, каждая из которых состоит из одного очищенного компонента, при этом концентрация в каждой отдельной зоне фактически однородна.

После элюирования последнего растворенного вещества необходимо удалить вытеснитель из колонки. Поскольку вытеснитель был выбран для высокого сродства, это может представлять проблему. На материалах с обращенной фазой может быть достаточно промывки с высоким процентом органического растворителя. Также часто используются большие сдвиги pH. Одной из эффективных стратегий является удаление вытеснителя с помощью химической реакции; например, если в качестве вытеснителя использовался ион водорода, его можно удалить реакцией с гидроксидом, или ион поливалентного металла можно удалить реакцией с хелатирующим агентом. Для некоторых матриц реактивные группы на неподвижной фазе можно титровать для временного устранения участков связывания, например, слабокислотные ионообменники или хелатирующие смолы можно преобразовать в протонированную форму. Для гелевых ионообменников изменение селективности при очень высокой ионной силе также может обеспечить решение. Иногда вытеснитель специально разработан с титруемой функциональной группой для смещения его сродства. После промывки вытеснителя колонка промывается по мере необходимости для восстановления ее исходного состояния для следующего запуска. ^{[6] [7] [8]}

В любой форме хроматографии скорость, с которой растворенное вещество движется вниз по колонке, является прямым отражением процента времени, которое растворенное вещество проводит в подвижной фазе. Для достижения разделения как в элюционной, так и в вытеснительной хроматографии должны быть заметные различия в сродстве соответствующих растворенных веществ к неподвижной фазе. Оба метода основаны на движении вниз по колонке для усиления эффекта небольших различий в распределении между двумя фазами. Распределение между подвижной и неподвижной фазами описывается изотермой связывания, графиком растворенного вещества, связанного с неподвижной фазой (или разделенного на нее), как функцией концентрации в подвижной фазе. Изотерма часто линейна или приблизительно такова при низких концентрациях, но обычно изгибается (вогнуто вниз) при более высоких концентрациях, когда неподвижная фаза становится насыщенной.

В режиме элюирования растворенные вещества наносятся на колонку в виде узких полос и при низкой концентрации перемещаются по колонке примерно в виде гауссовых пиков. Эти пики продолжают расширяться по мере перемещения пропорционально квадратному корню пройденного расстояния. Для того чтобы два вещества были разделены, они должны перемещаться по колонке с достаточно разными скоростями, чтобы преодолеть эффекты расширения полосы. Работа при высокой концентрации, когда изотерма изогнута, невыгодна в элюционной хроматографии, поскольку скорость перемещения тогда зависит от концентрации, что приводит к расширению и искажению пиков.

Удерживание в элюционной хроматографии обычно контролируется путем корректировки состава подвижной фазы (с точки зрения состава растворителя, pH, ионной силы и т. д.) в соответствии с типом используемой неподвижной фазы и конкретными растворенными веществами, которые необходимо разделить. Компоненты подвижной фазы обычно имеют более низкое сродство к неподвижной фазе, чем разделяемые растворенные вещества, но присутствуют в более высокой концентрации и достигают своего эффекта за счет действия масс . Разрешение в элюционной хроматографии обычно лучше, когда пики прочно удерживаются, но условия, которые обеспечивают хорошее разрешение ранних пиков, приводят к длительному времени выполнения и чрезмерному уширению более поздних пиков, если не используется градиентное элюирование . Градиентное оборудование добавляет сложности и затрат, особенно в больших масштабах.

В отличие от элюционной хроматографии, растворенные вещества, разделенные в режиме вытеснения, образуют зоны с острыми краями, а не распространяющиеся пики. Границы зон в вытеснительной хроматографии самообостряются: если молекула по какой-то причине опережает свою полосу, она попадает в зону, в которой она сильнее удерживается, и затем будет двигаться медленнее, пока ее зона не догонит ее. Кроме того, поскольку вытеснительная хроматография использует нелинейность изотерм, нагрузки намеренно высоки; на данной колонке можно разделить больше материала за данное время, при этом очищенные компоненты извлекаются в значительно более высоких концентрациях. Условия удерживания по-прежнему можно регулировать, но вытеснитель контролирует скорость миграции растворенных веществ. Вытеснитель выбирается так, чтобы иметь более высокое сродство к неподвижной фазе, чем любое из разделяемых растворенных веществ, и его концентрация устанавливается так, чтобы приближаться к насыщению неподвижной фазы и давать желаемую скорость миграции концентрационной волны. Условия высокого удерживания можно использовать без градиентной операции, поскольку вытеснитель обеспечивает удаление всех интересующих растворенных веществ за расчетное время выполнения. ^{[6] [7] [8]}

Из-за концентрирующего эффекта загрузки колонки в условиях высокого удержания вытеснительная хроматография хорошо подходит для очистки компонентов из разбавленных потоков подачи. Однако также возможно концентрировать материал из разбавленного потока в головке хроматографической колонки, а затем переключать условия для элюирования адсорбированного материала в обычных изократических или градиентных режимах. Таким образом, этот подход не является уникальным для вытеснительной хроматографии, хотя более высокая емкость загрузки и меньшее разбавление позволяют достичь большей концентрации в режиме вытеснения.

Недостатком вытеснительной хроматографии является то, что неидеальности всегда приводят к образованию зоны перекрытия между каждой парой компонентов; эта смешанная зона должна быть собрана отдельно для переработки или выброшена, чтобы сохранить чистоту разделенных материалов. Стратегия добавления молекул-спейсеров для формирования зон между компонентами (иногда называемая «хроматографией вытеснения носителя») была исследована ^[9] и может быть полезна, когда находятся подходящие, легко удаляемые спейсеры. Другим недостатком является то, что необработанную хроматограмму, например график поглощения или показателя преломления в зависимости от объема элюирования, может быть трудно интерпретировать для смежных зон, особенно если цепь вытеснения не полностью развита. Документирование и устранение неполадок могут потребовать дополнительного химического анализа для установления распределения данного компонента. Другим недостатком является то, что время, необходимое для регенерации, ограничивает пропускную способность.

Согласно статье Джона К. Форда в «Энциклопедии хроматографии» , теоретические исследования показывают, что, по крайней мере, для некоторых систем оптимизированная перегруженная элюционная хроматография обеспечивает более высокую пропускную способность, чем вытеснительная хроматография, хотя ограниченные экспериментальные испытания показывают, что вытеснительная хроматография превосходит ее (по крайней мере, до учета времени регенерации). ^[7]

Исторически вытеснительная хроматография применялась для препаративного разделения аминокислот и редкоземельных элементов, а также исследовалась для разделения изотопов. ^{[9] [10] [11] [12]}

Хроматографическая очистка белков из сложных смесей может быть довольно сложной, особенно когда смеси содержат схожие удерживаемые белки или когда желательно обогатить следовые компоненты в исходном материале. Кроме того, загрузка колонки часто ограничена, когда требуются высокие разрешения с использованием традиционных режимов хроматографии (например, линейный градиент, изократическая хроматография). В этих случаях вытеснительная хроматография является эффективным методом очистки белков из сложных смесей при высоких загрузках колонки в различных приложениях.

Важным достижением в области вытеснительной хроматографии стала разработка низкомолекулярных вытеснителей для очистки белков в ионообменных системах. ^{[13] [ 14] [15]} Это исследование было значимым, поскольку оно представляло собой существенный отход от общепринятого мнения о том, что для вытеснения белков в ионообменных системах требуются большие полиэлектролитные полимеры.

Низкомолекулярные вытеснители имеют значительные эксплуатационные преимущества по сравнению с большими полиэлектролитными вытеснителями. Например, если есть какое-либо перекрытие между вытеснителем и интересующим белком, эти материалы с низкой молекулярной массой могут быть легко отделены от очищенного белка во время обработки после вытеснения с использованием стандартных методов очистки на основе размера (например, гель-хроматография , ультрафильтрация ). Кроме того, зависимое от соли адсорбционное поведение этих низкомолекулярных вытеснителей значительно облегчает регенерацию колонки. Эти вытеснители использовались для широкого спектра разделений с высоким разрешением в ионообменных системах. ^{[16] [17] [18] [19] [20] [21] [22]} Кроме того, также была продемонстрирована полезность вытеснительной хроматографии для очистки рекомбинантных факторов роста , ^[23] антигенных вакцинных белков ^[24] и антисмысловых олигонуклеотидов ^[25] . Существует несколько примеров, в которых вытеснительная хроматография применялась для очистки белков с использованием ионного обмена , гидрофобного взаимодействия , а также обращенно-фазовой хроматографии . ^[26]

Вытеснительная хроматография хорошо подходит для получения мг-количеств очищенных белков из сложных смесей с использованием стандартных аналитических хроматографических колонок в лабораторном масштабе. Она также особенно хорошо подходит для обогащения следовых компонентов в сырье. Вытеснительная хроматография может быть легко проведена с использованием различных смоляных систем, включая ионный обмен, HIC и RPLC. ^[27]

Двумерная хроматография представляет собой наиболее тщательный и строгий подход к оценке протеома . В то время как ранее принятые подходы использовали хроматографические подходы в режиме элюирования, такие как катионный обмен на обращенно-фазовую ВЭЖХ , выходы, как правило, очень низкие, требуя аналитической чувствительности в пикомолярном и фемтомолярном диапазоне. ^[28] Поскольку вытеснительная хроматография дает преимущество в концентрации следовых компонентов, двумерная хроматография, использующая вытеснение, а не режим элюирования на этапе восходящей хроматографии, представляет собой потенциально мощный инструмент для анализа следовых компонентов, модификаций и идентификации второстепенных экспрессируемых компонентов протеома.