Детерминированное штрихкодирование в тканях для пространственного секвенирования Omics

Эта статья является сиротой , поскольку на нее не ссылаются другие статьи . Пожалуйста, введите ссылки на эту страницу из связанных статей ; попробуйте найти инструмент ссылок для предложений. ( Август 2022 г. )

Детерминированное штрихкодирование в тканях для пространственного секвенирования Omics ( DBiT-seq ) было разработано в Йельском университете Ронгом Фанем и его коллегами в 2020 году для создания подхода multi-omics для изучения гетерогенности пространственной экспрессии генов в образце ткани. ^[1] Этот метод можно использовать для совместного картирования уровней мРНК и белка с разрешением, близким к разрешению одной клетки, в свежих или замороженных образцах тканей, фиксированных формальдегидом. DBiT-seq использует секвенирование следующего поколения (NGS) и микрофлюидику . Этот метод позволяет проводить одновременный пространственный транскриптомный и протеомный анализ образца ткани. DBiT-seq улучшает предыдущие приложения пространственной транскриптомики , такие как High-Definition Spatial Transcriptomics (HDST) и Slide-seq, за счет увеличения количества обнаруживаемых генов на пиксель, повышения разрешения клеток и простоты реализации. ^{[1] [2] [3]}

В многоклеточных системах функция каждой отдельной клетки зависит от их пространственного расположения и окружения. ^{[4] [5]} Таким образом, внедрение DBiT-seq для профилирования как мРНК , так и уровней белка в ткани в пространственном контексте может привести к лучшему пониманию многих биологических процессов. DBiT-seq может использоваться во многих различных областях, таких как онкология , биология развития и патология . Использование в биологии развития может привести к лучшему пониманию того, как происходит органогенез , а в онкологии оно может дать более глубокое понимание роли гетерогенности в канцерогенезе и прогрессировании. ^{[6] [7] [8]}

DBiT-seq использует микрофлюидную систему для доставки олигонуклеотидных штрихкодов в точно контролируемом шаблоне. Система применяет два набора олигонуклеотидных штрихкодов (A1 – A50 и B1 – B50) перпендикулярно для создания сетки уникальных штрихкодов по всей секции, обозначенной как A1B1, A1B2 и т. д. ^[9]

DBiT-seq требует специально созданного микрофлюидного устройства для доставки штрихкодов. Микрофлюидика обеспечивает точную манипуляцию жидкостями в микронном масштабе. Устройство DBiTseq изготавливается с использованием полидиметилсилоксана (PDMS), отлитого в кремниевой пластине. ^[9] Устройство позволяет пользователю помещать жидкие реагенты в соответствующие каналы в макромасштабе без специального оборудования. Затем эти реагенты втягиваются вакуумом через каналы шириной 10, 25 или 50 мкм по поверхности среза ткани.

Другими компонентами устройства DBiT-seq являются два резервуара PDMS и система акриловых зажимов, удерживающая устройство вплотную к ткани.

Преимуществом DBiT-seq является возможность использования его на предметных стеклах тканей, консервированных формальдегидом в процессе, известном как фиксация тканей, что несовместимо с другими пространственными омиксными методиками. ^[1] Ткани замораживаются, фиксируются и разрезаются на очень тонкие срезы, которые устанавливаются на предметные стекла. Если требуется информация о белках в образце, ткань сначала окрашивается ДНК-метками, полученными из антител (ADT). ADT состоят из антитела, конъюгированного с олигонуклеотидом, содержащим уникальную последовательность штрихкода и последовательность хвоста поли-А. ^[10] Хвост поли-А будет распознаваться последовательностью поли-Т на штрихкоде А, что позволяет связать его с пространственным местоположением.

После окрашивания антителами (при желании) первый набор из 50 штрихкодов наносится на образец ткани с помощью первого микрофлюидного чипа. Каждый праймер «A» содержит уникальную последовательность штрихкода, лигирующий линкер и последовательность поли-T. Последовательность поли-T связывается с поли-A-хвостом на мРНК в образце ткани и на ADT, примененных ранее. Затем обратная транскрипция генерирует первую цепь кДНК , содержащую штрихкод и последовательность мРНК или тега антитела. Затем чип B наносится на тот же предметный столик. Чип B доставит второй набор штрихкодов перпендикулярно первому, создавая сетчатый рисунок. Каждый олигонуклеотид «B» содержит уникальную последовательность штрихкода, маркер ПЦР, лигирующий линкер и биотин для очистки кДНК. Последовательности лигирующих линкеров используются для лигирования штрихкодов A и B вместе в одну цепь ДНК. Наконец, этап лизиса извлекает кДНК из ткани в объединенный образец, содержащий все штрихкодированные цепи.

Лизат кДНК, полученный на этапе 3, очищается с использованием стрептавидиновых шариков, которые распознают биотин на штрихкоде B. Затем комплементарная цепь кДНК синтезируется с помощью обратной транскрипции, за которой следует ПЦР-амплификация и окончательная очистка библиотеки . Затем библиотека секвенируется с использованием секвенирования следующего поколения (Illumina) .

Слайд ткани визуализируется до, во время и после каждого шага штрихкодирования, чтобы обеспечить точную ассоциацию пространственной информации, полученной из штрихкодов. Ассоциирование штрихкодов с каждой последовательностью мРНК обеспечивает пространственную транскриптомную карту ткани. Хотя это не методология для одной клетки, каналы 10 мкМ захватывают только 1-2 клетки на квадрат, создавая разрешение, близкое к разрешению одной клетки. Последовательности ADT захватывают пространственную протеомную информацию, которую можно сравнить с транскриптомными данными. Конкретные популяции клеток можно идентифицировать двумя способами. Во-первых, путем сопоставления транскриптома с предыдущими профилями РНК-секвенирования одной клетки (scRNA-seq) для каждого типа клеток. ^[1] Во-вторых, с помощью пространственной дифференциальной экспрессии (SpatialDE), программного обеспечения для распознавания образов, которое может различать типы тканей без данных scRNA-seq . ^[11]

DBiT-seq обеспечивает преимущество перед другими методами пространственной омики, позволяя совместное картирование мРНК и белков. Это обеспечивает как транскриптомные, так и протеомные данные для анализа. Метод может быть легко реализован и адаптирован к потребностям исследователя и интересующим белкам. Этот метод может быть успешно использован на образцах тканей, окрашенных H&E и иммуноокрашенных , а также на образцах тканей, фиксированных формальдегидом. Каналы, используемые для штрихкодирования, можно изменять для настройки на требования к разрешению от 10 мкм, 25 мкм и 50 мкм.

Разрешение DBiT-seq не имеет разрешения отдельной клетки, но оно близко к разрешению отдельной клетки. Размер пикселя имеет теоретический предел ~5 мкм, что достаточно мало для наблюдения одной или части одной клетки, но не было реализовано. ^[1] При текущих конфигурациях каналов существует ограничение по размеру области картирования на ткани, использование каналов 10 мкм позволяет картировать только область ткани размером 1 мм × 1 мм. ^[1] Чтобы преодолеть это ограничение, можно добавить дополнительные каналы штрихкодирования для увеличения охватываемой области.

Ткани состоят из гетерогенных популяций клеток. Понимание того, как эти клетки работают вместе, и роли каждого типа клеток в ткани важно в таких областях, как исследование рака и биология развития. Хотя достижения в технологиях одноклеточной омики улучшили наши усилия по пониманию этих сложных сред, пространственной информации явно не хватало. ^{[1] [2]} Это было улучшено с появлением пространственной омики. DBiT-seq предоставляет доступный метод получения пространственной транскриптомной и протеомной информации из фиксированных или свежих срезов тканей. Благодаря разрешению 10, 25 или 50 мкм DBiT-seq обеспечивает разрешение, близкое к разрешению одной клетки, и предоставляет пространственные данные омики без необходимости использования высокоспециализированного оборудования для визуализации.