CITE-Seq

CITE-Seq ( Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing ) — это метод секвенирования РНК , а также получения количественной и качественной информации о поверхностных белках с помощью доступных антител на уровне одной клетки. ^[1] До сих пор было показано, что этот метод работает только с несколькими белками на клетку. Таким образом, он обеспечивает дополнительный уровень информации для той же клетки, объединяя данные протеомики и транскриптомики. Для фенотипирования этот метод показал такую ​​же точность, как проточная цитометрия (золотой стандарт) группами, которые его разработали. ^[2] В настоящее время это один из основных методов, наряду с REAP-Seq, для одновременной оценки экспрессии генов и уровней белков у разных видов.

Метод был разработан Нью-Йоркским геномным центром в сотрудничестве с лабораторией Сатиджи ^[2] , тогда как аналогичный подход ранее был продемонстрирован AbVitro Inc.

Одновременное измерение уровней белка и транскрипта открывает возможности для использования CITE-Seq в различных биологических областях, некоторые из которых были затронуты разработчиками. Например, его можно использовать для характеристики гетерогенности опухолей при различных видах рака, что является важной областью исследований. ^[3] Он также позволяет идентифицировать редкие субпопуляции клеток как высокопроизводительный метод одиночных клеток и, таким образом, обнаруживать информацию, которая в противном случае терялась бы при использовании массовых методов. ^[3] Он также может помочь в классификации опухолей, например, в идентификации новых подтипов. ^[3] Все вышеперечисленное возможно благодаря одновременному получению данных как белка, так и транскрипта от одной клетки, что также приводит к получению новой информации о корреляции белок-РНК.

Он также имеет потенциал в иммунологии. Например, его можно использовать для характеристики иммунных клеток — недавние исследования Т-клеток изучили способность Т-клеток поддерживать эффекторное состояние. ^[4] Другое исследование одного из соавторов CITE-Seq предложило CITE-Seq в качестве метода для изучения механизмов взаимодействия хозяина и патогена. ^[5]

CITE-seq, как и любая другая техника секвенирования, имеет часть влажной лаборатории, где готовятся фактические антитела, окрашиваются клетки, синтезируются кДНК и готовятся библиотеки РНК, которые затем секвенируются, и часть сухой лаборатории для анализа полученных данных секвенирования. Наиболее важной частью экспериментов влажной лаборатории является проектирование конъюгатов антитело-олигонуклеотид и титрование количества каждого конъюгата, которое должно присутствовать в пуле для достижения желаемого считывания и количественной оценки.

Первый этап включает подготовку конъюгатов антитело-олиго, также известных как теги , полученные из антител ( ADT). Подготовка ADT включает маркировку антитела, направленного против интересующего белка клеточной поверхности, олигонуклеотидами для штрихкодирования антитела.

После того, как у вас есть ADT, следующим шагом будет связывание клеток с желаемым пулом ADT. Библиотеки scRNA-seq могут быть подготовлены с использованием методов Drop-seq , 10X Genomics или ddSeq. Вкратце, клетки, помеченные ADT, инкапсулируются в каплю как отдельные клетки с микросферами со штрих-кодом ДНК. ^[6]

Внутри капли клетки затем лизируются для высвобождения как связанных ADT, так и мРНК. Затем они преобразуются в кДНК. Каждая последовательность ДНК на микросфере имеет уникальный штрихкод, таким образом индексируя кДНК с помощью штрихкодов клеток. кДНК готовится как из ADT, так и из клеточных мРНК.

На следующем этапе, в соответствии с рекомендациями разработчика, кДНК амплифицируется методом ПЦР, а кДНК ADT и кДНК мРНК разделяются по размеру (как правило, кДНК, полученные с помощью ADT, имеют размер < 180 п.н., а кДНК, полученные с помощью мРНК, имеют размер > 300 п.н.). ^[7] Каждая из разделенных молекул кДНК независимо амплифицируется и очищается для подготовки библиотек секвенирования. Наконец, независимые библиотеки объединяются и секвенируются. Таким образом, данные протеомики и транскриптомики могут быть получены из одного цикла секвенирования.

Анализ секвенирования отдельных клеток сопряжен со многими трудностями, такими как определение наилучшего способа нормализации данных. ^[8] Из-за нового уровня сложностей, возникающих при секвенировании как белков, так и транскриптов на уровне отдельных клеток, разработчики CITE-Seq и их коллеги поддерживают несколько инструментов, помогающих в анализе данных.

Анализ данных scRNA-Seq на основе руководств разработчика : ^{[2] [9]} Начальные этапы анализа такие же, как в стандартном эксперименте scRNA-Seq . Во-первых, чтения должны быть выровнены с референсным геномом интересующего вида, а клетки с очень низким числом транскриптов, сопоставленных с референсом, удаляются. Наконец, получается нормализованная матрица подсчета со значениями экспрессии генов.

Анализ данных ADT ^{[2] [7] [10] [11]} (на основе рекомендаций разработчика) : CITE-seq-Count — это пакет Python от разработчиков CITE-Seq, который можно использовать для получения сырых подсчетов. Пакет Seurat от лаборатории Satija дополнительно позволяет объединять подсчеты белка и РНК и выполнять кластеризацию по обоим измерениям, а также выполнять дифференциальный анализ экспрессии между интересующими кластерами клеток. Количественная оценка ADT должна учитывать различия между антителами. Кроме того, может потребоваться фильтрация для снижения шума, аналогично анализу scRNA-Seq . Но в отличие от данных РНК, из-за большего количества белка в клетке выпадение меньше.

Анализы могут привести к идентификации новых кластеров клеток с помощью таких методов, как PCA или tSNE, важных генов, отвечающих за определенную функцию клетки, и других новых знаний, специфичных для интересующего вопроса. В целом, результаты, полученные с помощью подсчетов ADT, существенно увеличивают объем информации, полученной с помощью транскриптомики отдельных клеток.

Применение конъюгатов антитело-олигонуклеотид вышло за рамки CITE-seq и может быть адаптировано для мультиплексирования образцов, а также для скрининга CRISPR .

Хеширование клеток: New York Genome Center дополнительно адаптировал использование своих конъюгатов антитело-олигонуклеотид для обеспечения мультиплексирования образцов для scRNA-seq . Эта техника, называемая хешированием клеток ^[12], использует меченые олигонуклеотидами антитела против повсеместно экспрессируемых белков клеточной поверхности из определенного образца ткани. В этом случае последовательность олигонуклеотидов содержит уникальный штрихкод, который будет специфичен для клеток из различных образцов. Эта специфичная для образца маркировка клеток позволяет объединять библиотеки секвенирования, подготовленные из разных образцов, на платформе секвенирования. Секвенирование тегов антител вместе с клеточным транскриптомом помогает идентифицировать образец происхождения для каждой анализируемой клетки. Уникальная последовательность штрихкода, используемая на антителе хеширования клеток, может быть разработана так, чтобы отличаться от штрихкода антитела, присутствующего на ADT, используемых в CITE-seq. Это позволяет связать хеширование клеток с CITE-seq в одном цикле секвенирования. ^[12] Хеширование клеток позволяет сверхзагрузить платформу scRNA-seq, что приводит к снижению стоимости секвенирования. Это также позволяет обнаруживать артефактные сигналы от мультиплетов, что является основной проблемой в scRNA-seq . Метод хеширования клеток был далее использован Gaublomme et al. для мультиплексирования одноядерной РНК-seq ( snRNA-seq ) путем выполнения хеширования ядер. ^[13]

ECCITE-seq: Расширенное C RISPR -совместимое клеточное индексирование транскриптомов и эпитопов путем секвенирования или ECCITE-seq было разработано для применения CITE-seq для характеристики множественных модальностей из одной клетки. Модифицируя базовый протокол CITE -seq до анализа scRNA-seq на основе 5'-тегов, он может обнаруживать транскриптом, клонотипы иммунных рецепторов, поверхностные маркеры, идентичность образца и одиночные направляющие РНК (sgRNA) из каждой отдельной клетки. ^[14] Способность ECCITE-seq обнаруживать молекулы sgRNA и измерять их влияние на уровни экспрессии генов открывает перспективу применения этой техники в скринингах CRISPR.

Преимущества: CITE-seq позволяет одновременно анализировать транскриптом и протеом отдельных клеток. Предыдущие попытки объединения измерений индексной сортировки из отдельных клеток с scRNA-seq были ограничены запуском небольшого размера выборки и не были совместимы с мультиплексированием и массивным параллельным высокопроизводительным секвенированием. Было показано, что CITE-seq совместим с высокопроизводительными микрофлюидными платформами, такими как 10X Genomics и Drop-seq . Он также адаптируется к платформам микро/нано-луночных ячеек. Объединение его с хешированием клеток позволяет применять CITE-seq к объемным образцам и мультиплексированию образцов. Эти методы работают для снижения общей стоимости высокопроизводительного секвенирования для нескольких образцов. Наконец, CITE-seq можно адаптировать для обнаружения малых молекул, РНК-интерференции, CRISPR и других методов редактирования генов.

Ограничения: Одним из ограничений CITE-Seq является потеря информации о местоположении. Из-за способа обработки клеток пространственное распределение клеток в образце, а также белков в клетке неизвестно. ^{[15] [9]} Кроме того, этот метод разделяет проблемы scRNA-Seq, такие как большое количество шума и возможные проблемы при обнаружении низкоэкспрессируемых генов. ^[9] С точки зрения фенотипирования, оптимизация анализа и антител также представляет потенциальную проблему, если интересующие белки не включены в доступные в настоящее время панели. ^[16] Более того, прямо сейчас CITE-Seq не может обнаруживать внутриклеточные белки. ^[16] При текущем протоколе существует множество проблем, которые могут возникнуть на этапе пермеабилизации, что ограничивает метод поверхностными маркерами.

• REAP-seq: Петерсон и др. из Merck разработали метод, похожий на CITE-seq, который называется анализ экспрессии РНК и секвенирования белков (REAP-seq). Хотя REAP-seq, подобно CITE-seq, измеряет уровни как транскриптов, так и белков в одной клетке, разница между двумя методами заключается в том, как антитело конъюгируется с олигонуклеотидами. CITE-seq обычно связывает олигонуклеотид с антителом нековалентно, посредством конъюгации стрептавидина с антителом и конъюгации биотина с олигонуклеотидом. REAP-seq ковалентно связывает антитело и аминированный ДНК-штрихкод ^[17]
• PLAYR: PLAYR или Proximal Ligation Assay для РНК использует масс-спектрометрию для одновременного анализа уровней транскриптома и белка в отдельных клетках. В этой технике как белки, так и транскрипты РНК маркируются изотопно-конъюгированными антителами и изотопно-мечеными зондами, соответственно, что позволяет их обнаружение на масс-спектрометре ^[18]