перетасовка ДНК
Точечные мутации приводят к изменениям отдельных нуклеотидов, тогда как вставки и делеции приводят к добавлению или удалению нуклеотидов соответственно. [1] [2] Перетасовка ДНК обеспечивает рекомбинацию родительских генов, что значительно увеличивает скорость направленной эволюции. [3] Перетасовка ДНК полезна для создания белков с новыми свойствами или комбинациями желаемых свойств. [1]

Перетасовка ДНК , также известная как молекулярная селекция, представляет собой метод случайной рекомбинации in vitro для генерации мутантных генов для направленной эволюции и для обеспечения быстрого увеличения размера библиотеки ДНК . [1] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] Три процедуры для выполнения перетасовки ДНК — это молекулярная селекция, которая основана на гомологичной рекомбинации или сходстве последовательностей ДНК, рестрикционные ферменты , которые полагаются на общие сайты рестрикции , и негомологичная случайная рекомбинация, которая требует использования шпилек . [1] Во всех этих методах родительские гены фрагментируются, а затем рекомбинируются. [1] [4]

Перетасовка ДНК использует случайную рекомбинацию в отличие от сайт-направленного мутагенеза для того, чтобы генерировать белки с уникальными атрибутами или комбинациями желаемых характеристик, закодированных в родительских генах, таких как термостабильность и высокая активность. [1] [8] Потенциал перетасовки ДНК для производства новых белков иллюстрируется рисунком, показанным справа, который демонстрирует разницу между точечными мутациями, вставками и делециями, и перетасовкой ДНК. [1] В частности, этот рисунок показывает использование перетасовки ДНК на двух родительских генах, что позволяет генерировать рекомбинантные белки, которые имеют случайную комбинацию последовательностей из каждого родительского гена. [1] Это отличается от точечных мутаций , в которых один нуклеотид был изменен, вставлен или удален, и вставок или делеций, где последовательность нуклеотидов была добавлена ​​или удалена, соответственно. [1] [2] В результате случайной рекомбинации перетасовка ДНК способна производить белки с новыми качествами или несколькими выгодными характеристиками, полученными из родительских генов. [1] [4]

В 1994 году Виллем П.К. Штеммер опубликовал первую статью о перетасовке ДНК. [7] С момента появления этой техники перетасовка ДНК применялась к белковым и низкомолекулярным фармацевтическим препаратам, биоремедиации , вакцинам , генной терапии и эволюционирующим вирусам. [3] [10] [11] [12] Другие методы, которые дают результаты, схожие с перетасовкой ДНК, включают случайный химерагенез на временных матрицах (RACHITT), случайную печать in vitro рекомбинации (RPR) и процесс ступенчатого расширения (StEP). [4] [7] [13]  

История

Перетасовка ДНК методом молекулярной селекции была впервые описана в 1994 году Виллемом П. С. Штеммером. [1] [7] Он начал с фрагментации гена β-лактамазы , который был амплифицирован с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), с использованием ДНКазы I , которая случайным образом расщепляет ДНК. [14] [15] Затем он завершил модифицированную реакцию ПЦР, в которой праймеры не использовались, что привело к отжигу гомологичных фрагментов или фрагментов со схожими последовательностями. [14] Наконец, эти фрагменты были амплифицированы с помощью ПЦР. [14] Штеммер сообщил, что использование перетасовки ДНК в сочетании с обратным скрещиванием привело к устранению несущественных мутаций и увеличению производства антибиотика цефотаксима . [ 14] Он также подчеркнул потенциал молекулярной эволюции с помощью перетасовки ДНК. [16] В частности, он указал, что этот метод может быть использован для модификации белков. [16]   

С тех пор перетасовка ДНК применялась для создания библиотек гибридных или химерных генов и вдохновила на семейную перетасовку, которая определяется как использование родственных генов в перетасовке ДНК. [17] [18] [19] Кроме того, перетасовка ДНК применялась к белковым и низкомолекулярным фармацевтическим препаратам, биоремедиации, генной терапии, вакцинам и эволюционировавшим вирусам. [3] [10] [11] [12] [20]

Процедуры

Молекулярное разведение

Сначала ДНКаза I используется для фрагментации набора родительских генов на сегменты двухцепочечной ДНК размером от 10-50 п.н. до более 1 к.п.н. [4] [16] Затем следует ПЦР без праймеров. [14] В ПЦР фрагменты ДНК с достаточно перекрывающимися последовательностями будут отжигаться друг с другом, а затем удлиняться ДНК-полимеразой . [1] [4] [5] [7] [14] [16] [21] Удлинение ПЦР не произойдет, если только не будет последовательностей ДНК с высоким сходством. [1] Важными факторами, влияющими на последовательности, синтезируемые при перетасовке ДНК, являются ДНК-полимераза, концентрации солей и температура отжига. [10] Например, использование Taq-полимеразы для амплификации фрагмента размером 1 к.п.н. в ПЦР из 20 циклов приводит к получению от 33% до 98% продуктов, содержащих одну или несколько мутаций. [21]

Для амплификации фрагментов можно использовать несколько циклов ПЦР-расширения. [1] [4] [5] [7] [14] [16] [21] Добавление праймеров, которые разработаны так, чтобы быть комплементарными концам расширенных фрагментов, добавляется для дальнейшей амплификации последовательностей с помощью другой ПЦР. [1] [14] [21] Праймеры можно выбирать так, чтобы на их 5'-концах были добавлены дополнительные последовательности, такие как последовательности для сайтов распознавания рестриктаз , которые необходимы для лигирования в клонирующий вектор . [1] [14]

Можно рекомбинировать части родительских генов для создания гибридов или химерных форм с уникальными свойствами, отсюда и термин «перетасовка ДНК». [22] Недостатком молекулярной селекции является требование сходства между последовательностями, что вдохновило на разработку других процедур перетасовки ДНК. [1]

Ферменты рестрикции

Для фрагментации родительских генов используются рестриктазы. [1] [21] Затем фрагменты соединяются вместе посредством лигирования, которое можно выполнить с помощью ДНК-лигазы . [1] Например, если два родительских гена имеют три сайта рестрикции, можно создать четырнадцать различных полноразмерных гибридных генов. [1] Количество уникальных полноразмерных гибридов определяется тем фактом, что ген с тремя сайтами рестрикции можно разбить на четыре фрагмента . [1] Таким образом, существует два варианта для каждой из четырех позиций за вычетом комбинаций, которые воссоздали бы два родительских гена, что дает 2 4 - 2 = 14 различных полноразмерных гибридных генов . [1]

Главное отличие между перетасовкой ДНК с помощью рестриктаз и молекулярной селекцией заключается в том, что молекулярная селекция опирается на гомологию последовательностей для отжига цепей и ПЦР для удлинения, тогда как при использовании рестриктаз создаются концы фрагментов, которые можно лигировать. [1] Главные преимущества использования рестриктаз включают контроль над количеством событий рекомбинации и отсутствие необходимости в амплификации ПЦР. [1] [23] Главным недостатком является необходимость общих участков рестриктаз. [1]

Негомологичная случайная рекомбинация

Для создания сегментов размером от 10-50 п.н. до более 1 к.б. используется ДНКаза I. [4] [16] [24] Концы фрагментов затупляются путем добавления ДНК-полимеразы T4. [1] [24] Затупление фрагментов важно для объединения фрагментов, поскольку несовместимые липкие концы или выступы предотвращают соединение концов. [1] [25] [26] Затем к смеси фрагментов добавляются шпильки с определенным сайтом рестрикции. [1 ] [24] Затем для лигирования фрагментов с образованием расширенных последовательностей используется ДНК-лигаза T4. [1] [24] Лигирование шпилек с фрагментами ограничивает длину расширенных последовательностей, предотвращая добавление дополнительных фрагментов. [1] Наконец, для удаления петель шпилек используется фермент рестрикции. [1] [24]

Негомологичная случайная рекомбинация отличается от молекулярной селекции тем, что гомология лигированных последовательностей не является необходимой, что является преимуществом. [1] Однако , поскольку этот процесс рекомбинирует фрагменты случайным образом, существует вероятность того, что большая часть рекомбинированных последовательностей ДНК не будет иметь желаемых характеристик, что является недостатком. [1] Негомологичная случайная рекомбинация также отличается от использования рестриктаз для перетасовки ДНК тем, что общие сайты рестриктаз на родительских генах не требуются, а использование шпилек является необходимым, что демонстрирует преимущество и недостаток негомологичной случайной рекомбинации по сравнению с использованием рестриктаз, соответственно. [1]

Приложения

Белковые и низкомолекулярные фармацевтические препараты

Поскольку перетасовка ДНК обеспечивает рекомбинацию генов, активность белков может быть повышена. [3] [20] Например, перетасовка ДНК использовалась для повышения эффективности фаговых рекомбинантных интерферонов на мышиных и человеческих клетках. [3] Кроме того, улучшение зеленого флуоресцентного белка (GFP) было достигнуто с помощью перетасовки ДНК путем молекулярной селекции, поскольку был получен сигнал в 45 раз больший, чем стандарт для флуоресценции всей клетки. [20] Более того, синтез различных генов также может привести к производству белков с новыми свойствами. [1] Поэтому перетасовка ДНК использовалась для разработки белков для детоксикации химических веществ. [3] [27] Например, метод гомологичной рекомбинации перетасовки ДНК путем молекулярной селекции использовался для улучшения детоксикации атразина и арсената . [3] [27]  

Биоремедиация

Перетасовка ДНК также использовалась для улучшения деградации биологических загрязнителей. [12] [28] В частности, рекомбинантный штамм E. coli был создан с использованием перетасовки ДНК путем молекулярной селекции для биоремедиации трихлорэтилена (ТХЭ), потенциального канцерогена , который менее восприимчив к токсичным эпоксидным промежуточным продуктам. [12] [21] [28]

Вакцина

Возможность выбора желаемых рекомбинантов с помощью перетасовки ДНК использовалась в сочетании со стратегиями скрининга для улучшения вакцин-кандидатов против инфекций с акцентом на улучшение иммуногенности , производства вакцины, стабильности и перекрестной реактивности к нескольким штаммам патогенов. [3] [10] Были исследованы некоторые вакцины-кандидаты против Plasmodium falciparum , вируса денге , энцефалитических альфавирусов (включая: VEEV , WEEV и EEEV ), вируса иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1) и вируса гепатита B (HBV). [10]   

Генная терапия и эволюционировавшие вирусы

Требования к генной терапии человека включают высокую чистоту, высокий титр и стабильность. [11] Перетасовка ДНК позволяет создавать ретровирусные векторы с этими характеристиками. [11] Например, перетасовка ДНК с молекулярной селекцией была применена к шести штаммам экотропного вируса лейкемии мышей (MLV), что привело к составлению обширной библиотеки рекомбинантных ретровирусов и идентификации множественных клонов с повышенной стабильностью. [11] Кроме того, применение перетасовки ДНК с молекулярной селекцией на множественных родительских векторах аденоассоциированного вируса (AAV) было использовано для создания библиотеки из десяти миллионов химер. [29] Полученные выгодные характеристики включают повышенную устойчивость к человеческому внутривенному иммуноглобулину (IVIG) и выработку клеточного тропизма в новых вирусах. [29]   

Сравнение с другими методами

Хотя перетасовка ДНК стала полезным методом для случайной рекомбинации, для этой цели были разработаны и другие методы, включая RACHITT, RPR и StEP. [4] [13] Ниже приведены некоторые преимущества и недостатки этих других методов рекомбинации. [4] [7] [13]

РЭЧИТТ

В RACHITT фрагменты одноцепочечных (ss) родительских генов отжигаются на матрице ss, что приводит к уменьшению несоответствий, что является преимуществом. [13] Кроме того, RACHIIT позволяет рекомбинировать гены с низким сходством последовательностей. [7] Однако основным недостатком является подготовка фрагментов ss родительских генов и матрицы ss. [7] [13]

РПР

RPR использует случайные праймеры. [30] Эти случайные праймеры отжигаются с шаблонной ДНК и затем удлиняются фрагментом Кленова . [30] Затем шаблоны удаляются, а фрагменты собираются по гомологии в процессе, похожем на ПЦР. [30] Некоторые основные преимущества включают меньшую потребность в родительских генах из-за использования шаблонов ss и повышенное разнообразие последовательностей из-за неправильного старта и неправильного включения. [7] [30] Одним из недостатков RPR является подготовка шаблона. [30]  

Шаг

В StEP для создания полноразмерных последовательностей используются короткие циклы отжига праймера на матрице и удлинения полимеразой. [31] [32] Основными преимуществами StEP являются простота метода и отсутствие очистки фрагментов. [7] [13] Недостатками StEP являются то, что он занимает много времени и требует гомологии последовательностей. [7] [13]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ abcdefghijklmnopqrstu vwxyz aa ab ac ad ae af ag ah ai Glick BR ​​(2017). Молекулярная биотехнология: принципы и применение рекомбинантной ДНК. Шерил Л. Паттен (Пятое изд.). Вашингтон, округ Колумбия. ISBN 978-1-55581-936-1. OCLC  975991667.{{cite book}}: CS1 maint: отсутствует местоположение издателя ( ссылка )
  2. ^ ab Levi T, Sloutskin A, Kalifa R, Juven-Gershon T, Gerlitz O (2020-07-14). "Эффективное введение точечных мутаций in vivo с использованием ssODN и подхода Co-CRISPR". Biological Procedures Online . 22 (1): 14. doi : 10.1186/s12575-020-00123-7 . PMC 7362497. PMID  32684853 . 
  3. ^ abcdefghi Patten PA, Howard RJ, Stemmer WP (декабрь 1997 г.). «Применение перетасовки ДНК в фармацевтических препаратах и ​​вакцинах». Current Opinion in Biotechnology . 8 (6): 724– 733. doi :10.1016/S0958-1669(97)80127-9. PMID  9425664.
  4. ^ abcdefghij Cirino PC, Qian S (2013-01-01), Zhao H (ред.), "Глава 2 - Белковая инженерия как инструмент для синтетической биологии", Synthetic Biology , Бостон: Academic Press, стр.  23–42 , doi :10.1016/b978-0-12-394430-6.00002-9, ISBN 978-0-12-394430-6
  5. ^ abc Clark DP, Pazdernik NJ (2016), «Белковая инженерия», Биотехнология , Elsevier, стр.  365–392 , doi :10.1016/b978-0-12-385015-7.00011-9, ISBN 978-0-12-385015-7
  6. ^ Камада Х (2013-01-01), Парк К, Цунода СИ (ред.), "5 - Генерация функциональных мутантных белков для создания высокобиоактивных противораковых биофармацевтических препаратов", Биоматериалы для терапии рака , Woodhead Publishing, стр.  95–112 , doi :10.1533/9780857096760.2.95, ISBN 978-0-85709-664-7
  7. ^ abcdefghijkl Биопереработка для получения продукции с добавленной стоимостью из возобновляемых ресурсов: новые технологии и приложения. Шан-Тянь Ян (1-е изд.). Амстердам: Elsevier. 2007. ISBN 978-0-444-52114-9. OCLC  162587118.{{cite book}}: CS1 maint: others (link)
  8. ^ ab Arkin M (2001-01-01), "Мутагенез in vitro", в Brenner S, Miller JH (ред.), Encyclopedia of Genetics , Нью-Йорк: Academic Press, стр.  1010–1014 , doi :10.1006/rwgn.2001.0714, ISBN 978-0-12-227080-2
  9. ^ Маршалл SH (ноябрь 2002 г.). «Перетасовка ДНК: индуцированное молекулярное разведение для производства нового поколения долгосрочных вакцин». Biotechnology Advances . 20 ( 3–4 ): 229–238 . doi :10.1016/s0734-9750(02)00015-0. PMID  14550030.
  10. ^ abcde Locher CP, Paidhungat M, Whalen RG, Punnonen J (апрель 2005 г.). «Стратегии перетасовки и скрининга ДНК для повышения эффективности вакцин». DNA and Cell Biology . 24 (4): 256– 263. doi :10.1089/dna.2005.24.256. PMID  15812242.
  11. ^ abcde Powell SK, Kaloss MA, Pinkstaff A, McKee R, Burimski I, Pensiero M и др. (декабрь 2000 г.). «Выведение ретровирусов путем перетасовки ДНК для повышения стабильности и производительности обработки». Nature Biotechnology . 18 (12): 1279– 1282. doi :10.1038/82391. PMID  11101807. S2CID  1865270.
  12. ^ abcd Rui L, Kwon YM, Reardon KF, Wood TK (май 2004 г.). «Инженерия метаболических путей для усиления аэробного разложения хлорированных этэнов и снижения их токсичности путем клонирования новой глутатион-S-трансферазы, эволюционировавшей толуол-o-монооксигеназы и гамма-глутамилцистеин-синтетазы». Environmental Microbiology . 6 (5): 491– 500. doi :10.1111/j.1462-2920.2004.00586.x. PMID  15049922.
  13. ^ abcdefg Курцман АЛ, Говиндараджан С, Вахле К, Джонс ДЖТ, Хайнрихс В, Паттен ПА (август 2001 г.). «Достижения в направленной эволюции белков с помощью рекурсивной генетической рекомбинации: применение к терапевтическим белкам». Current Opinion in Biotechnology . 12 (4): 361– 370. doi :10.1016/S0958-1669(00)00228-7. PMID  11551464.
  14. ^ abcdefghi Stemmer WP (август 1994). «Быстрая эволюция белка in vitro путем перетасовки ДНК». Nature . 370 (6488): 389– 391. Bibcode :1994Natur.370..389S. doi :10.1038/370389a0. PMID  8047147. S2CID  4363498.
  15. ^ "ДНКаза I (без РНКазы) | NEB". www.neb.com . Получено 2021-10-30 .
  16. ^ abcdef Stemmer WP (октябрь 1994 г.). «Перетасовка ДНК случайной фрагментацией и повторной сборкой: рекомбинация in vitro для молекулярной эволюции». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 91 (22): 10747– 10751. Bibcode : 1994PNAS...9110747S. doi : 10.1073 /pnas.91.22.10747 . PMC 45099. PMID  7938023. 
  17. ^ Кикучи М., Охниши К., Хараяма С. (2000-02-08). «Эффективный метод перетасовки семей с использованием одноцепочечной ДНК». Gene . 243 (1): 133– 137. doi :10.1016/S0378-1119(99)00547-8. ISSN  0378-1119. PMID  10675621.
  18. ^ Crameri A, Raillard SA, Bermudez E, Stemmer WP (январь 1998 г.). «Перетасовка ДНК семейства генов различных видов ускоряет направленную эволюцию». Nature . 391 (6664): 288– 291. Bibcode :1998Natur.391..288C. doi :10.1038/34663. PMID  9440693. S2CID  4352696.
  19. ^ Coco WM, Levinson WE, Crist MJ, Hektor HJ, Darzins A, Pienkos PT и др. (апрель 2001 г.). «Метод перетасовки ДНК для получения высокорекомбинированных генов и эволюционировавших ферментов». Nature Biotechnology . 19 (4): 354–359 . doi :10.1038/86744. PMID  11283594. S2CID  35360374.
  20. ^ abc Crameri A, Whitehorn EA, Tate E, Stemmer WP (март 1996). «Улучшенный зеленый флуоресцентный белок с помощью молекулярной эволюции с использованием перетасовки ДНК». Nature Biotechnology . 14 (3): 315– 319. doi :10.1038/nbt0396-315. PMID  9630892. S2CID  22803570.
  21. ^ abcdef Zhao H, Arnold FH (март 1997). «Оптимизация перетасовки ДНК для высокоточной рекомбинации». Nucleic Acids Research . 25 (6): 1307– 1308. doi : 10.1093 /nar/25.6.1307. PMC 146579. PMID  9092645. 
  22. ^ Bacher JM, Reiss BD, Ellington AD (июль 2002 г.). «Опережающая эволюция и перетасовка ДНК». Genome Biology . 3 (8): REVIEWS1021. doi : 10.1186/gb-2002-3-8-reviews1021 . PMC 139397. PMID  12186650. 
  23. ^ Engler C, Gruetzner R, Kandzia R, Marillonnet S (2009-05-14). "Golden gate shuffling: метод однопотоковой перетасовки ДНК на основе рестриктаз типа IIs". PLOS ONE . ​​4 (5): e5553. Bibcode :2009PLoSO...4.5553E. doi : 10.1371/journal.pone.0005553 . PMC 2677662 . PMID  19436741. 
  24. ^ abcde Bittker JA, Le BV, Liu JM, Liu DR (май 2004 г.). «Направленная эволюция белковых ферментов с использованием негомологичной случайной рекомбинации». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 101 (18): 7011– 7016. Bibcode :2004PNAS..101.7011B. doi : 10.1073/pnas.0402202101 . PMC 406457 . PMID  15118093. 
  25. ^ Zhu S, Peng A (июнь 2016 г.). "Репарация негомологичного соединения концов в экстракте яиц Xenopus". Scientific Reports . 6 (1): 27797. Bibcode :2016NatSR...627797Z. doi :10.1038/srep27797. PMC 4914968 . PMID  27324260. 
  26. ^ Огивара Х., Коно Т. (14.12.2011). "Основные факторы несовместимого соединения концов ДНК при двуцепочечных разрывах хромосомной ДНК in vivo". PLOS ONE . 6 (12): e28756. Bibcode : 2011PLoSO...628756O. doi : 10.1371/journal.pone.0028756 . PMC 3237495. PMID  22194904 . 
  27. ^ ab Crameri A, Dawes G, Rodriguez E, Silver S, Stemmer WP (май 1997). «Молекулярная эволюция пути детоксикации арсената путем перетасовки ДНК». Nature Biotechnology . 15 (5): 436– 438. doi :10.1038/nbt0597-436. PMID  9131621. S2CID  25669058.
  28. ^ ab Canada KA, Iwashita S, Shim H, Wood TK (январь 2002 г.). «Направленная эволюция орто-монооксигеназы толуола для улучшенного синтеза 1-нафтола и деградации хлорированного этена». Журнал бактериологии . 184 (2): 344–349 . doi :10.1128/JB.184.2.344-349.2002. PMC 139589. PMID  11751810 . 
  29. ^ ab Koerber JT, Jang JH, Schaffer DV (октябрь 2008 г.). «ДНК-перетасовка аденоассоциированного вируса приводит к получению функционально разнообразного вирусного потомства». Molecular Therapy . 16 (10): 1703– 1709. doi :10.1038/mt.2008.167. PMC 2683895 . PMID  18728640. 
  30. ^ abcde Esteban O, Woodyer RD, Zhao H (2003). "In vitro DNA recombination by random priming". В Arnold FH, Georgiou G (eds.). Directed Evolution Library Creation . Methods in Molecular Biology. Vol. 231. Totowa, NJ: Humana Press. pp.  99– 104. doi :10.1385/1-59259-395-x:99. ISBN 978-1-59259-395-8. PMID  12824607.
  31. ^ Zhao H, Giver L, Shao Z, Affholter JA, Arnold FH (март 1998). «Молекулярная эволюция с помощью процесса ступенчатого расширения (StEP) in vitro рекомбинации». Nature Biotechnology . 16 (3): 258– 261. doi :10.1038/nbt0398-258. PMID  9528005. S2CID  20490024.
  32. ^ Агуинальдо AM, Арнольд ФХ (2003). "Процесс ступенчатого расширения (StEP) in vitro рекомбинации". В Arnold FH, Georgiou G (ред.). Создание библиотеки направленной эволюции . Методы в молекулярной биологии. Т. 231. Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. стр.  105–110 . doi :10.1385/1-59259-395-X:105. ISBN 978-1-59259-395-8. PMID  12824608.
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=DNA_shuffling&oldid=1176353428"