Фрагмент Кленова

Большой фрагмент белка

Функциональные домены в фрагменте Кленова (слева) и ДНК-полимеразе I (PDB).

Фрагмент Кленова — это большой фрагмент белка, который образуется при ферментативном расщеплении ДНК-полимеразы I из E. coli протеазой субтилизином . Впервые описанный в 1970 году ^[1], он сохраняет 5' → 3'- полимеразную активность и 3' → 5'- экзонуклеазную активность для удаления прекодирующих нуклеотидов и корректуры, но теряет 5' → 3'-экзонуклеазную активность.

Другой меньший фрагмент, образующийся при расщеплении ДНК-полимеразы I из E. coli субтилизином, сохраняет 5' → 3' экзонуклеазную активность, но не обладает двумя другими видами активности, проявляемыми фрагментом Кленова (т. е. 5' → 3' полимеразной активностью и 3' → 5' экзонуклеазной активностью).

Исследовать

Поскольку 5' → 3' экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы I из E. coli делает ее непригодной для многих применений, фрагмент Кленова, в котором отсутствует эта активность, может быть очень полезен в исследованиях. Фрагмент Кленова чрезвычайно полезен для исследовательских задач, таких как:

Синтез двухцепочечной ДНК из одноцепочечных матриц
Заполнение отступающих 3'-концов фрагментов ДНК, чтобы сделать 5'-выступ тупым
Переваривание выпирающих 3-футовых свесов
Приготовление радиоактивных ДНК-зондов

Фрагмент Кленова также был исходным ферментом, использовавшимся для значительного увеличения сегментов ДНК в процессе полимеразной цепной реакции (ПЦР) ^[2] , прежде чем его заменили термостабильные ДНК-полимеразы, такие как полимераза Taq . ^[3]

Фрагмент экзо-Кленова

Так же, как 5' → 3' экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы I из E.coli может быть нежелательной, 3' → 5' экзонуклеазная активность фрагмента Кленова также может быть нежелательной для определенных приложений. Эту проблему можно преодолеть, внеся мутации в ген, кодирующий фрагмент Кленова. Это приводит к экспрессии форм фермента, которые сохраняют 5' → 3' полимеразную активность, но лишены какой-либо экзонуклеазной активности (5' → 3' или 3' → 5'). Эта форма фермента называется экзо-фрагментом Кленова .

Фрагмент экзо-Кленова используется в некоторых реакциях флуоресцентной маркировки для микрочипов, а также в реакциях dA и dT, важном этапе в процессе лигирования адаптеров ДНК с фрагментами ДНК, часто используемом при подготовке библиотек ДНК для секвенирования следующего поколения. (например, см. [1])

Ссылки

^ Кленов Х. и Хеннингсен И. (1970). «Селективное устранение экзонуклеазной активности полимеразы дезоксирибонуклеиновой кислоты из Escherichia coli B путем ограниченного протеолиза». Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 65 (1): 168– 175. Bibcode : 1970PNAS...65..168K. doi : 10.1073 /pnas.65.1.168 . PMC 286206. PMID 4905667.
^ Saiki RK, et al. (1985). «Ферментативная амплификация геномных последовательностей β-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии». Science . 230 (4732): 1350–54 . Bibcode :1985Sci...230.1350S. doi :10.1126/science.2999980. PMID 2999980.
^ Saiki RK, et al. (1988). «Праймер-направленная ферментативная амплификация ДНК с термостабильной ДНК-полимеразой». Science . 239 (4839): 487– 91. doi :10.1126/science.239.4839.487. PMID 2448875.

Внешние ссылки

Klenow+Fragment в Национальной медицинской библиотеке США, медицинские предметные рубрики (MeSH)
Диаграмма на vivo.colostate.edu

[1] Кленов Х. и Хеннингсен И. (1970). «Селективное устранение экзонуклеазной активности полимеразы дезоксирибонуклеиновой кислоты из Escherichia coli B путем ограниченного протеолиза». Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 65 (1): 168– 175. Bibcode : 1970PNAS...65..168K. doi : 10.1073 /pnas.65.1.168 . PMC 286206. PMID 4905667.

[Saiki1-2] Saiki RK, et al. (1985). «Ферментативная амплификация геномных последовательностей β-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии». Science . 230 (4732): 1350–54 . Bibcode :1985Sci...230.1350S. doi :10.1126/science.2999980. PMID 2999980.

[Saiki3-3] Saiki RK, et al. (1988). «Праймер-направленная ферментативная амплификация ДНК с термостабильной ДНК-полимеразой». Science . 239 (4839): 487– 91. doi :10.1126/science.239.4839.487. PMID 2448875.