ДНК-конструкция

ДНК -конструкция — это искусственно созданный сегмент ДНК, переносимый вектором , который может использоваться для включения генетического материала в целевую ткань или клетку . [1] ДНК-конструкция содержит вставку ДНК , называемую трансгеном , доставляемую через вектор трансформации , который позволяет реплицировать и/или экспрессировать последовательность вставки в целевой клетке. Этот ген может быть клонирован из встречающегося в природе гена, [2] или сконструирован синтетически. [3] Вектор может быть доставлен с использованием физических, химических или вирусных методов. [4] Обычно векторы, используемые в ДНК-конструкциях, содержат начало репликации , сайт множественного клонирования и селективный маркер . [2] Некоторые векторы могут нести дополнительные регуляторные элементы на основе задействованной системы экспрессии. [5]

Конструкции ДНК могут быть всего лишь несколькими тысячами пар оснований (кбн) ДНК, несущей один ген, с использованием векторов, таких как плазмиды или бактериофаги , или большими, сотнями кбн для крупномасштабных геномных исследований с использованием искусственной хромосомы. [2] Конструкция ДНК может экспрессировать белок дикого типа, предотвращать экспрессию определенных генов, экспрессируя конкурентов или ингибиторы, или экспрессировать мутантные белки, такие как делеционные мутации или миссенс-мутации . Конструкции ДНК широко адаптированы в исследованиях молекулярной биологии для таких методов, как секвенирование ДНК, экспрессия белков и исследования РНК. [5]

История

Первый стандартизированный вектор, pBR220, был разработан в 1977 году исследователями в лаборатории Герберта Бойера. Плазмида содержит различные сайты рестриктаз и стабильный ген устойчивости к антибиотикам, свободный от транспозонной активности. [6]

В 1982 году Джеффри Виейра и Иоахим Мессинг описали разработку векторов pUC, полученных из M13mp7, которые состоят из множественного сайта клонирования и позволяют более эффективно секвенировать и клонировать с использованием набора универсальных праймеров M13. Три года спустя те же ученые сконструировали популярную в настоящее время плазмиду pUC19. [7]

Строительство

Ген в интересующей последовательности ДНК может быть либо клонирован из существующей последовательности, либо разработан синтетически. Чтобы клонировать естественную последовательность в организме, ДНК организма сначала разрезается ферментами рестрикции , которые распознают последовательности ДНК и разрезают их вокруг целевого гена. Затем ген может быть амплифицирован с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Обычно этот процесс включает использование коротких последовательностей, известных как праймеры, для первоначальной гибридизации с целевой последовательностью; кроме того, точечные мутации могут быть введены в последовательности праймеров, а затем скопированы в каждом цикле для модификации целевой последовательности. [2]

Также возможно синтезировать целевую цепь ДНК для конструкции ДНК. Короткие цепи ДНК, известные как олигонуклеотиды, могут быть разработаны с использованием синтеза на основе колонок, в котором основания добавляются по одному за раз к цепи ДНК, прикрепленной к твердой фазе. Каждое основание имеет защитную группу для предотвращения связывания, которое не удаляется, пока следующее основание не будет готово к добавлению, гарантируя, что они связаны в правильной последовательности. Олигонуклеотиды также могут быть синтезированы на микрочипе, что позволяет синтезировать десятки тысяч последовательностей одновременно, чтобы снизить стоимость. [3] Для синтеза более крупного гена олигонуклеотиды разрабатываются с перекрывающимися последовательностями на концах, а затем соединяются вместе. Наиболее распространенный метод называется сборкой циклов полимеразы (PCA): фрагменты гибридизуются в перекрывающихся областях и удлиняются, и в каждом цикле создаются более крупные фрагменты. [2]

После того, как последовательность выделена, ее необходимо вставить в вектор . Самый простой способ сделать это — разрезать векторную ДНК с помощью рестриктаз; если те же самые энзимы использовались для выделения целевой последовательности, то на каждом конце будут созданы те же самые «выступающие» последовательности, что позволит осуществить гибридизацию. После того, как целевой ген гибридизовался с векторной ДНК, их можно соединить с помощью ДНК -лигазы . [2] Альтернативная стратегия использует рекомбинацию между гомологичными сайтами на целевом гене и векторной последовательности, что устраняет необходимость в рестриктазах. [8]

Способы доставки

Существует три основные категории доставки конструкций ДНК: физические, химические и вирусные. [4] Физические методы, которые доставляют ДНК путем физического проникновения в клетку, включают микроинъекцию , электропорацию и биолистику . [9] Химические методы основаны на химических реакциях для доставки ДНК и включают трансформацию с клетками, сделанными компетентными с использованием фосфата кальция, а также доставку с помощью липидных наночастиц. [10] [11] Вирусные методы используют различные вирусные векторы для доставки ДНК, включая аденовирус , лентивирус и вирус простого герпеса [12]

Векторная структура

Помимо целевого гена, в векторе есть три важных элемента: начало репликации, селектируемый маркер и сайт множественного клонирования. Начало репликации — это последовательность ДНК, которая запускает процесс репликации ДНК, позволяя вектору клонировать себя. Сайт множественного клонирования содержит сайты связывания для нескольких рестриктаз, что упрощает вставку различных последовательностей ДНК в вектор. Селектируемый маркер придает некоторую черту, по которой можно легко провести отбор в клетке-хозяине, чтобы можно было определить, была ли трансформация успешной. Наиболее распространенными селектируемыми маркерами являются гены устойчивости к антибиотикам, поэтому клетки-хозяева без конструкции погибнут при воздействии антитела, и останутся только клетки-хозяева с конструкцией. [2]

Типы конструкций ДНК

Широко используемый плазмидный вектор pET28a [13]
  • Бактериальные плазмиды представляют собой кольцевые участки ДНК, которые естественным образом реплицируются в бактериях. [2] Плазмиды способны удерживать вставки длиной примерно до 20 кб. Эти типы конструкций обычно содержат ген, обеспечивающий устойчивость к антибиотикам, точку начала репликации, регуляторные элементы, такие как ингибиторы Lac , полилинкер и белковую метку , которая облегчает очистку белка. [14]
  • Векторы бактериофагов — это вирусы, способные инфицировать бактерии и реплицировать собственную ДНК. [2]
  • Искусственные хромосомы обычно используются в исследованиях геномных проектов из-за их способности удерживать вставки до 350 кбн. Эти векторы получены из плазмиды F , используя преимущества высокой стабильности и конъюгационной способности, привнесенные фактором F. [15]
  • Фосмиды представляют собой гибрид между бактериальными плазмидами F и методами клонирования λ-фага. Вставки предварительно упакованы в фаговые частицы, затем вставлены в клетку-хозяина с возможностью удерживать ~45 кбн. Обычно они используются для создания библиотеки ДНК из-за их повышенной стабильности. [16]

Приложения

Конструкции ДНК могут использоваться для производства белков, включая как природные белки, так и сконструированные мутантные белки. Эти белки могут использоваться для создания терапевтических продуктов, таких как фармацевтические препараты и антитела. Конструкции ДНК также могут изменять уровни экспрессии других генов, экспрессируя регуляторные последовательности, такие как промоторы и ингибиторы. Кроме того, конструкции ДНК могут использоваться для исследований, таких как создание геномных библиотек, секвенирование клонированной ДНК и изучение экспрессии РНК и белков. [5]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Пинкерт, Карл (2014). Трансгенная технология животных: лабораторное руководство . Амстердам: Elsevier. С. 692. ISBN 9780124095366.
  2. ^ abcdefghi Картер, Мэтт; Ши, Дженнифер К. (2010), «Молекулярное клонирование и технология рекомбинантной ДНК», Руководство по методам исследований в области нейронауки , Elsevier, стр. 207–227, doi :10.1016/b978-0-12-374849-2.00009-4, ISBN 978-0-12-374849-2, получено 2021-11-10
  3. ^ ab Хьюз, Рэндалл А.; Эллингтон, Эндрю Д. (январь 2017 г.). «Синтетический синтез и сборка ДНК: внедрение синтетического в синтетическую биологию». Cold Spring Harbor Perspectives in Biology . 9 (1): a023812. doi :10.1101/cshperspect.a023812. ISSN  1943-0264. PMC 5204324. PMID  28049645 . 
  4. ^ ab Картер, Мэтт; Ши, Дженнифер К. (2010), «Стратегии доставки генов», Руководство по методам исследования в области нейронауки , Elsevier, стр. 229–242, doi :10.1016/b978-0-12-374849-2.00010-0, ISBN 978-0-12-374849-2, получено 2020-10-24
  5. ^ abc Глик, Бернард Р.; Паттен, Шерил Л. (2017). Молекулярная биотехнология: принципы и применение рекомбинантной ДНК . Вашингтон, округ Колумбия: ASM Press.
  6. ^ Боливар, Франциско; Родригес, Рэймонд Л.; Бетлах, Мэри К.; Бойер, Герберт В. (1977-11-01). «Конструирование и характеристика новых клонирующих транспортных средств I. Ампициллин-устойчивые производные плазмиды pMB9». Gene . 2 (2): 75–93. doi :10.1016/0378-1119(77)90074-9. ISSN  0378-1119. PMID  344136.
  7. ^ Яниш-Перрон, Селеста; Виейра, Джеффри; Мессинг, Иоахим (1985-01-01). «Улучшенные векторы клонирования фага M13 и штаммы-хозяева: нуклеотидные последовательности векторов M13mpl8 и pUC19». Gene . 33 (1): 103–119. doi :10.1016/0378-1119(85)90120-9. ISSN  0378-1119. PMID  2985470.
  8. ^ Коупленд, Нил Г.; Дженкинс, Нэнси А.; Корт, Дональд Л. (октябрь 2001 г.). «Рекомбинация: новый мощный инструмент для функциональной геномики мышей». Nature Reviews Genetics . 2 (10): 769–779. doi :10.1038/35093556. ISSN  1471-0064. PMID  11584293. S2CID  10916548.
  9. ^ Mehierhumbert, S; Guy, R (2005-04-05). "Физические методы переноса генов: улучшение кинетики доставки генов в клетки". Advanced Drug Delivery Reviews . 57 (5): 733–753. doi :10.1016/j.addr.2004.12.007. PMID  15757758.
  10. ^ Felgner, PL; Gadek, TR; Holm, M.; Roman, R.; Chan, HW; Wenz, M.; Northrop, JP; Ringold, GM; Danielsen, M. (1987-11-01). «Липофекция: высокоэффективная процедура трансфекции ДНК с использованием липидов». Труды Национальной академии наук . 84 (21): 7413–7417. Bibcode : 1987PNAS...84.7413F. doi : 10.1073/pnas.84.21.7413 . ISSN  0027-8424. PMC 299306. PMID 2823261  . 
  11. ^ Кингстон, Роберт Э.; Чен, Клаудия А.; Роуз, Джон К. (2003). «Трансфекция фосфата кальция». Current Protocols in Molecular Biology . 63 (1): 9.1.1–9.1.11. doi :10.1002/0471142727.mb0901s63. ISSN  1934-3647. PMID  18265332. S2CID  46188175.
  12. ^ Роббинс, Пол Д.; Гивиццани, Стивен К. (1998). «Вирусные векторы для генной терапии». Фармакология и терапия . 80 (1): 35–47. doi :10.1016/S0163-7258(98)00020-5. PMID  9804053.
  13. ^ Шен, Эйми; Лупардус, Патрик Дж.; Морелл, Монтсе; Пондер, Элизабет Л.; Садагиани, А. Масуд; Гарсия, К. Кристофер; Богио, Мэтью (2009-12-02). Сюй, Вэньцин (ред.). «Упрощенная, улучшенная очистка белка с использованием индуцибельной, автопроцессирующей ферментной метки». PLOS ONE . 4 (12): e8119. Bibcode : 2009PLoSO...4.8119S. doi : 10.1371/journal.pone.0008119 . ISSN  1932-6203. PMC 2780291. PMID 19956581  . 
  14. ^ Гриффитс, Энтони Дж. Ф. (2015). Введение в генетический анализ . Нью-Йорк: WH Freeman & Company. ISBN 978-1464188046.
  15. ^ Godiska, R.; Wu, C. -C.; Mead, DA (2013-01-01), «Геномные библиотеки», в Maloy, Stanley; Hughes, Kelly (ред.), Brenner's Encyclopedia of Genetics (второе издание) , San Diego: Academic Press, стр. 306–309, doi :10.1016/b978-0-12-374984-0.00641-0, ISBN 978-0-08-096156-9, получено 2020-11-06
  16. ^ Ху, Бо; Хара, Пратик; Кристи, Питер Дж. (2019-07-09). «Структурные основы конъюгации плазмиды F и биогенеза пилей F в Escherichia coli». Труды Национальной академии наук . 116 (28): 14222–14227. Bibcode : 2019PNAS..11614222H. doi : 10.1073/pnas.1904428116 . ISSN  0027-8424. PMC 6628675. PMID 31239340  . 
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=DNA_construct&oldid=1246235531"