Дактилоскопия сообщества

Дактилоскопия сообщества — это набор методов молекулярной биологии , которые можно использовать для быстрого профилирования разнообразия микробного сообщества. Вместо того, чтобы напрямую идентифицировать или подсчитывать отдельные клетки в образце окружающей среды, эти методы показывают, сколько вариантов гена присутствует . В целом предполагается, что каждый отдельный вариант гена представляет собой отдельный тип микроба. Дактилоскопия сообщества используется микробиологами , изучающими различные микробные системы (например, морские, пресноводные, почвенные и человеческие микробные сообщества) для измерения биоразнообразия или отслеживания изменений в структуре сообщества с течением времени. Метод анализирует образцы окружающей среды путем анализа геномной ДНК . Этот подход предлагает альтернативу микробному культивированию , что важно, поскольку большинство микробов невозможно культивировать в лаборатории. ^[1] Дактилоскопия сообщества не приводит к идентификации отдельных видов микробов; вместо этого она представляет общую картину микробного сообщества. Эти методы в настоящее время в значительной степени заменяются высокопроизводительным секвенированием, таким как целевой анализ микробиома (например, секвенирование 16s рРНК) и метагеномикой .

Анализ дактилоскопии начинается с образца окружающей среды (например, морской воды или почвы), из которого извлекается общая ДНК. (Общая ДНК содержит смесь генетического материала всех микробов, присутствующих в образце.) Затем в качестве цели для анализа выбирается определенный ген или участок ДНК, исходя из предположения, что каждый вид микроба будет иметь другой вариант гена (также называемый « филотипом »). Для визуализации филотипов, присутствующих в образце, можно использовать различные методы (см. ниже). Поскольку целью дактилоскопии сообщества является получение общего представления о структуре сообщества, это особенно полезный метод для анализа данных временных рядов, собранных в полевых условиях. Например, можно изучить схему микробной сукцессии в среде обитания или можно изучить реакцию микробного сообщества на возмущение окружающей среды, такое как выброс загрязняющего вещества. В зависимости от того, какая информация необходима, могут быть выбраны различные гены. Наиболее распространенными являются гены малой субъединицы рибосомальной РНК (рРНК), такие как 16S рРНК . Эти гены часто используются в микробных филогенетических анализах, поэтому существуют хорошо зарекомендовавшие себя методы их изучения. Другие гены, представляющие интерес, могут быть теми, которые играют ключевую роль в различных метаболических процессах. ^[1]

Преимуществами дактилоскопии сообщества являются то, что ее можно выполнять быстро и относительно дешево, а анализы могут охватывать большое количество образцов одновременно. ^{[2] [3]} Эти свойства делают дактилоскопию сообщества особенно полезной для мониторинга изменений в микробных сообществах с течением времени. Кроме того, методы дактилоскопии не требуют наличия априорных данных о последовательности организмов в образце. Недостатком дактилоскопии сообщества является то, что она дает в основном качественные, а не количественные данные. ^[4] При использовании качественных данных может быть сложно сравнивать закономерности, наблюдаемые в разных исследованиях или между разными исследователями. Кроме того, дактилоскопия сообщества не идентифицирует таксоны напрямую в образце окружающей среды, хотя выходные данные определенных методов (например, DGGE ) можно анализировать дополнительно, если требуется идентификация. Некоторые авторы указывают на плохую воспроизводимость результатов для определенных методов дактилоскопии, ^[3] в то время как другие авторы критиковали неточность оценок численности и неспособность некоторых методов фиксировать присутствие редких таксонов. ^[5] Например, методу DGGE сложно обнаружить микробы, составляющие менее 0,5%-1% бактериального сообщества. ^[6]

В этом разделе представлены три метода дактилоскопии населения.

Полиморфизм длины терминальных рестрикционных фрагментов (T-RFLP) — это метод, который использует флуоресцентно -меченые фрагменты ДНК для получения отпечатка пальца сообщества. ^{[2] [7]} В этом разделе представлено краткое объяснение T-RFLP в конкретном контексте дактилоскопии сообщества . Более подробное объяснение см. в статье T-RFLP .

Для выполнения T-RFLP (рисунок 1) необходимо выбрать целевой ген (например, ген 16S рРНК) для амплификации с помощью ПЦР . По крайней мере один праймер , используемый в реакции ПЦР, флуоресцентно помечен на 5´ конце. После амплификации ПЦР каждый скопированный сегмент ДНК несет флуоресцентную метку. Затем рестриктазы используются для разрезания амплифицированной ДНК в определенных сайтах распознавания . Основное предположение заключается в том, что каждый микроб в образце будет иметь различную последовательность на целевом гене, поэтому рестриктаза будет резать ДНК каждого микроба в разном месте. (Каждый разный сайт рестрикции считается представляющим одну операционную таксономическую единицу [OTU]). Таким образом, фермент будет производить одну длину фрагмента для каждого типа микроба, присутствующего в образце. Результатом переваривания является набор рестрикционных фрагментов разной длины, каждый из которых флуоресцентно помечен на одном конце. Они известны как «концевые фрагменты», потому что они помечены на конце, где прикреплен праймер ПЦР. (Немаркированные концы не регистрируются в окончательном анализе.) Затем фрагменты разделяются по размеру с помощью гелевого или капиллярного электрофореза . Лазерное обнаружение фиксирует размер и интенсивность флуоресценции концевых фрагментов. Стандарты ДНК известного размера и флуоресценции включаются в анализ в качестве ссылок. При установке минимального порога для флуоресценции фоновый шум будет исключен. ^[4]

Выходной результат этапа лазерного обнаружения представляет собой электрофореграмму , которая показывает ряд пиков с длиной фрагмента на горизонтальной оси и интенсивностью флуоресценции на вертикальной оси (рисунок 1). Второй выходной результат ^[4] представляет собой таблицу данных, в которой указано время миграции фрагментов, размер в парах оснований каждого пика, а также высота и площадь под каждым пиком.

Теоретическая основа T-RFLP предполагает, что пики в разных положениях вдоль горизонтальной оси представляют разные типы организмов (или OTU). Площадь под каждым пиком интенсивности флуоресценции является показателем относительной распространенности каждого филотипа в сообществе. Однако необходимо учитывать ряд оговорок. Различные типы организмов могут иметь общий сайт рестрикции в интересующем гене; в этом случае эти организмы не будут различаться как разные пики на электрофореграмме. Кроме того, площадь под пиком представляет собой относительное, а не абсолютное распространенность, и существуют смещения в измерении распространенности и амплификации ПЦР. Например, организмы, которых мало в исходном общем образце ДНК, не будут амплифицированы достаточно, чтобы быть обнаруженными в окончательном анализе. ^[7] Это приводит к недооценке разнообразия сообщества. Лю и др. ^[7] приводят другие возможные факторы, которые могут исказить результаты, включая «различия в числе копий гена между видами и смещения, внесенные во время лизиса клеток, выделения ДНК и амплификации ПЦР» (стр. 4521). Для тех, кто ищет подробную техническую информацию, Марш ^[2] предоставляет каталог потенциальных предубеждений, которые могут быть внесены на каждом этапе процесса T-RFLP.

Главные преимущества T-RFLP в том, что он быстрый и может легко вместить много образцов. ^[2] Кроме того, визуальный вывод упрощает сравнение моделей структуры сообщества в разных образцах. Недостатком является широкий, качественный характер вывода данных, который должен интерпретироваться с учетом вышеуказанных оговорок. Кроме того, прямая идентификация микробов в образце невозможна с помощью T-RFLP.

Disayathanoowat et al. ^[8] использовали T-RFLP для оценки микробного сообщества кишечника, или микробиома, у двух видов медоносных пчел в Таиланде. Они обнаружили, что эти два вида содержат разные микробные сообщества и что микробиом меняется в течение жизни пчел.

Joo et al. ^[9] протестировали T-RFLP как метод мониторинга фитопланктона. Авторы собирали пробы воды из водохранилищ в течение определенного периода времени. После сравнения образцов с известными терминальными фрагментами рестрикции (из базы данных, созданной на основе культур), они пришли к выводу, что T-RFLP можно эффективно использовать в качестве метода мониторинга изменений в сообществе фитопланктона. Однако оценки разнообразия и численности оказались менее точными, чем те, которые были получены с помощью других методов.

Электрофорез в градиентном денатурирующем геле (DGGE) — это метод микробной дактилоскопии, который разделяет ампликоны примерно одинакового размера на основе свойств последовательности ^[1] (рисунок 2). Эти свойства определяют порог, при котором ДНК денатурирует. Гель DGGE использует градиентный денатурант ДНК (смесь мочевины и формамида) или линейный температурный градиент. ^[10] Когда фрагмент достигает точки плавления (порог достаточного количества денатуранта), он перестает двигаться. Это связано с тем, что частично расплавленная двухцепочечная ДНК больше не может мигрировать через гель. ^[11] Зажим GC (около 40 оснований с высоким содержанием GC) используется в качестве специального праймера для закрепления фрагментов ПЦР вместе после их денатурации . ^[12]

Каждая полоса на геле представляет одно микробное сообщество. Общие полосы среди образцов имеют одинаковый размер и примерно одинаковое положение на геле. Варианты генов, которые не являются общими среди образцов микробного сообщества, не совпадают по горизонтали с другими. Например, если интересующий ген — это 16S рРНК, как это было, когда метод был впервые описан, фрагменты, амплифицированные ПЦР, будут находиться в том же вертикальном положении, поскольку все они примерно одинакового размера. ^[13] Другой целевой ген может иметь большую вариацию длины, но градиент денатуранта использует второй элемент (точку плавления) для дальнейшего различения образцов. Гель DGGE разделит гены одинакового размера на основе последовательности оснований.

Этот метод показывает, в какой степени микробные сообщества одинаковы или различны по таксономическому составу. Каждая полоса в разном месте на геле представляет собой разный филотип (одну уникальную последовательность гена филогенетического маркера). ^[1] Для микробных сообществ этот метод профилирует множество отдельных последовательностей 16S рРНК. ^[14] Количество полос в разных горизонтальных положениях можно использовать для оценки уровня биоразнообразия в этом образце и вывода о филогенетической принадлежности. ^[10] Чтобы узнать больше о филогенетической принадлежности, можно вырезать эти полосы из геля, а затем секвенировать их.

Использование профиля денатурации служит способом разделения фрагментов ДНК схожих размеров. Это полезно при оценке микробного разнообразия из-за того, что ген 16S рРНК не сильно различается по размеру в разных бактериальных типах. Гель DGGE обеспечивает быстрый способ изучения биоразнообразия в микробном образце и не исключает возможность секвенирования интересующих полос. Этот метод не требует культивирования микробов в лаборатории и не требует никаких данных о последовательностях, необходимых для разработки зондов для методов гибридизации. ^[10] Главным недостатком является то, что это качественная оценка биоразнообразия, и необходимо секвенировать гены, чтобы сделать выводы о филогенетическом родстве. Другим недостатком является то, что зажим GC может быть переменным каждый раз, когда он синтезируется. Это приводит к возможности получения различных профилей DGGE для одной и той же последовательности 16S рРНК. ^[12]

Стивен и др. ^[15] использовали DGGE для быстрого анализа протеобактерий в почве. Они получили первоначальную оценку микробного разнообразия в своих образцах окружающей среды из почвы, которая поддерживалась в течение 36 лет при различных значениях pH. Они объединили DGGE и методы гибридизации, исследуя фрагменты ДНК, чтобы получить более подробную информацию о природных популяциях. В этом исследовании они изучали группу близкородственных типов бактерий, все из которых являются автотрофными β-протеобактериальными окислителями аммиака. Образцы 16S рДНК давали неоднозначные перекрывающиеся полосы при разведении на геле. Неоднозначные перекрывающиеся полосы были разделены с помощью кластер-специфичных радиоактивно меченых зондов, которые давали информацию об относительном обилии различных генотипов в образцах.

Уорд и др. ^[14] исследовали сообщества цианобактериальных матов в горячем источнике Йеллоустоуна, используя анализ DGGE сегментов гена 16S рРНК аэробных хемоорганотрофных популяций. DGGE позволил им профилировать сообщество, получая новое понимание разнообразия. Они охарактеризовали интересующие полосы путем очистки и секвенирования и обнаружили множество ранее неизвестных линий.

(Автоматизированный) рибосомный межгенный спейсерный анализ , или (A)RISA (рисунок 3), использует тот факт, что прокариотическая ДНК кодирует два высококонсервативных гена, ген 16SrRNA и ген 23SrRNA. Они кодируют гены малой и большой субъединиц в опероне рРНК. Между этими двумя генами находится внутренняя транскрибируемая спейсерная область (ITS). Поскольку она не кодирует белки, она имеет очень изменчивую нуклеотидную последовательность и длину. После того, как ДНК выделяется из сообщества, ПЦР амплифицирует эту спейсерную область. Фрагменты можно вывести на гель (RISA), или флуоресцентные праймеры можно перевести в пики в изобилии различных длин фрагментов на электрофореграмме (ARISA). ^{[16] [17]}

Из-за вариабельности некодирующих областей выходной результат RISA представляет собой гель с различными рисунками полос, а выходной результат ARISA представляет собой электрофореграмму с различными пиками (аналогично T-RFLP).

Яркость флуоресцентно маркированных праймеров коррелирует с тем, насколько распространен этот тип бактерий в сообществе. Рисунок полос на геле можно интерпретировать как профиль, специфичный для сообщества. Каждая полоса или пик ДНК указывает по крайней мере на одного представителя этого организма. ^[16] В RISA полосы на геле, которые не совпадают по длине, представляют разные организмы в сообществе, поскольку они имеют разные спейсерные области между двумя высококонсервативными генами. Электрофореграмма показывает пики, коррелирующие с относительной распространенностью этой спейсерной области в образце.

ARISA может иметь более высокое разрешение при обнаружении микробного разнообразия по сравнению с T-RFLP . ^[18] Этот метод дактилоскопии является быстрым и чувствительным методом оценки микробного разнообразия. Наблюдаемые неоднородности длины можно сравнить с базами данных для перекрытия с культивируемыми организмами. ^[16] Можно разработать олигонуклеотидные праймеры на уровне филума, чтобы получить вопросы, касающиеся филогенетических групп. ^[16] Одним из недостатков ARISA является тот факт, что один организм может вносить более одного пика в профиль сообщества. Неродственные организмы также могут иметь схожие длины спейсеров, что приводит к недооценке разнообразия сообщества. Из-за этих смещений исследователи часто используют этот метод на нескольких образцах из каждого сообщества, чтобы получить среднюю оценку.

Ранджард и др. ^[17] обсуждают несколько примеров типов исследований, в которых может использоваться RISA. Они ссылаются на несколько исследований, в которых эта техника использовалась для идентификации бактериальных сообществ после таких нарушений, как лечение антибиотиками, ртутный стресс и вырубка лесов. Они также продемонстрировали успешное использование ARISA для характеристики грибковых сообществ, что является аспектом микробной экологии, который еще предстоит полностью изучить.

Шлосс и др. ^[19] провели исследование, изучающее экологические переменные и связывающее их с изменениями в микробной экологии компостной кучи. Они использовали ARISA для профилирования структуры сообщества и изучения микробной сукцессии на этапах процесса компостирования. Они взяли образцы ДНК и секвенировали ген 16S рРНК, чтобы идентифицировать членов сообщества на разных этапах процесса. Затем они использовали ARISA, чтобы изучить изменения в масштабах сообщества, а затем сопоставили последовательность гена 16S рРНК с наиболее распространенными фрагментами ARISA, чтобы идентифицировать этих членов микробного сообщества.