Изоляция клеток

Изоляция клеток — это процесс отделения отдельных живых клеток от твердого блока ткани или клеточной суспензии. В то время как некоторые типы клеток естественным образом существуют в разделенной форме (например, клетки крови ), другие типы клеток, которые находятся в твердой ткани, требуют специальных методов для их разделения на отдельные клетки. Это может быть выполнено с помощью ферментов для переваривания белков , которые связывают эти клетки вместе во внеклеточном матриксе . После того, как матричные белки были переварены, клетки остаются слабо связанными вместе, но их можно аккуратно разделить механически. После выделения на этих отдельных изолированных клетках можно проводить эксперименты, включая электрофизиологию с патч-клампом , визуализацию флуоресценции кальция и иммуноцитохимию . 

Методы

Изображение изолированных взрослых сердечных миоцитов , полученное с помощью конфокальной микроскопии

Циркулирующие клетки

Методы, необходимые для получения изолированных клеток, различаются в зависимости от требуемого типа клеток. Циркулирующие клетки, такие как клетки крови или некоторые опухолевые клетки, могут быть изолированы путем взятия образца крови. [1] Поскольку образцы крови содержат смесь многих различных типов клеток, необходимо использовать метод разделения клеток на различные типы. Наиболее часто используемым методом для этого является проточная цитометрия , во время которой автоматический анализатор проверяет узкий поток клеток. В одной из версий этого метода свет освещает поток клеток, и анализатор обнаруживает отраженный свет или флуоресценцию, прежде чем использовать эту информацию для быстрого перемещения интересующих клеток в камеру для сбора. [2]

Твердые ткани

При работе с твердыми тканями получение ткани для выделения клеток может быть более сложным. Избыток человеческой ткани иногда может быть получен во время плановой операции, например, образцы правого предсердного ушка часто вырезаются и выбрасываются во время операции на открытом сердце, такой как аортокоронарное шунтирование . [3]  Другие ткани, такие как образцы поджелудочной железы или мочевого пузыря, могут быть взяты в качестве биопсии. В качестве альтернативы, ткань от животных часто получают путем жертвоприношения животного. [4]

После получения образца ткани его необходимо окружить или пропитать раствором при соответствующей температуре, содержащим соли и питательные вещества, необходимые для поддержания жизни клеток. Это можно сделать, просто погрузив ткань в раствор, или можно использовать более сложные методы, такие как перфузия по Лангендорфу . [3] Обычно используемые растворы включают модификации раствора Тироде или раствора Кребса и Хенселейта . Эти растворы содержат точные концентрации электролитов, включая натрий , калий , кальций , магний , фосфат , хлорид и глюкозу . Концентрации этих электролитов должны быть тщательно сбалансированы с учетом осмотического давления. Кислотность раствора необходимо регулировать, часто используя буфер pH, такой как HEPES . Изоляция клеток из некоторых тканей может быть улучшена путем насыщения раствора кислородом. [3] На начальных этапах перфузия ткани раствором, не содержащим кальций, полезна, особенно при изоляции сердечных миоцитов , поскольку отсутствие кальция вызывает разделение вставочных дисков . [5]

Затем в раствор можно добавить протеолитические ферменты . Ферменты, которые расщепляют коллаген ( коллагеназы ), часто используются при выделении клеток из сердца или мочевого пузыря. [3] [4] [6] Также можно использовать ферменты общего назначения, которые расщепляют многие виды белков ( протеазы ). [3] При выделении клеток из мозговой ткани могут потребоваться другие ферменты, которые расщепляют ДНК (ДНКазы). [7]

Эти ферменты, в дополнение к перевариванию внеклеточного матрикса, могут также переваривать другие важные белки, необходимые для функционирования интересующих клеток. Если клетки подвергаются воздействию этих ферментов слишком долго, то происходит гибель клеток, но если они не подвергаются воздействию ферментов достаточно долго, то переваривание внеклеточного матрикса не будет полным. После того, как ферменты были удалены из ткани путем перфузии ее вторым раствором, который не содержит ферментов, клетки можно механически разделить или диссоциировать. Простая техника диссоциации клеток заключается в разрезании ткани на небольшие кусочки перед перемешиванием кусочков в растворе с помощью пипетки. [3] [4]

Использует

Изолированные клетки можно использовать для изучения того, как работают клетки, как они изменяются в ответ на болезнь и как на них влияют лекарства. Примером экспериментальной техники, которая использует изолированные клетки, является электрофизиология с пэтч-клампом , используемая для изучения того, как заряженные частицы проходят через клеточную мембрану . Дополнительные методы включают флуоресцентную визуализацию кальция с использованием красителей, которые излучают свет в ответ на кальций, чтобы измерить, как кальций регулируется внутри клетки, и иммуноцитохимию , которая использует антитела, помеченные флуоресцентным маркером, чтобы определить, где внутри клетки расположены белки. [8] Изолированные клетки также можно использовать для клеточной культуры , в которой одна клетка размножается, чтобы создать колонию клеток. [4]

Изоляция клеток также может быть использована как часть лечения. Изоляция островковых клеток поджелудочной железы с последующим их культивированием и трансплантацией использовалась для лечения пациентов с диабетом 1 типа . [9]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Бхагват Н., Карпентер Э.Л. (2017). «Методы проточной цитометрии для выделения циркулирующих опухолевых клеток и молекулярного анализа». Изоляция и молекулярная характеристика циркулирующих опухолевых клеток . Достижения в экспериментальной медицине и биологии. Т. 994. С. 105–118.  doi : 10.1007 /978-3-319-55947-6_5. ISBN 978-3-319-55946-9. PMID  28560670.
  2. ^ Ху П., Чжан В., Синь Х., Дэн Г. (2016). «Изоляция и анализ отдельных клеток». Frontiers in Cell and Developmental Biology . 4 : 116. doi : 10.3389/fcell.2016.00116 . PMC 5078503. PMID  27826548. 
  3. ^ abcdef Voigt N, Pearman CM, Dobrev D, Dibb KM (сентябрь 2015 г.). «Методы изоляции клеток предсердий у крупных млекопитающих и людей». Журнал молекулярной и клеточной кардиологии . 86 : 187–98 . doi : 10.1016/j.yjmcc.2015.07.006 . PMID  26186893.
  4. ^ abcd Louch WE, Sheehan KA, Wolska BM (сентябрь 2011 г.). «Методы изоляции, культивирования и переноса генов кардиомиоцитов». Журнал молекулярной и клеточной кардиологии . 51 (3): 288– 98. doi :10.1016/j.yjmcc.2011.06.012. PMC 3164875. PMID  21723873 . 
  5. ^ Yates JC, Dhalla NS (февраль 1975). «Структурные и функциональные изменения, связанные с отказом и восстановлением сердца после перфузии средой, не содержащей Ca2+». Журнал молекулярной и клеточной кардиологии . 7 (2): 91– 103. doi :10.1016/0022-2828(75)90011-5. PMID  1121035.
  6. ^ Kloskowski T, Uzarska M, Gurtowska N, Olkowska J, Joachimiak R, Bajek A, Gagat M, Grzanka A, Bodnar M, Marszałek A, Drewa T (апрель 2014 г.). «Как изолировать уротелиальные клетки? Сравнение четырех различных методов и обзор литературы». Human Cell . 27 (2): 85– 93. doi :10.1007/s13577-013-0070-y. PMID  24368576. S2CID  9966872.
  7. ^ Chew LJ, DeBoy CA, Senatorov VV (октябрь 2014 г.). «Нахождение степеней разделения: экспериментальные подходы к изоляции астроглиальных и олигодендроглиальных клеток и генетическому нацеливанию». Journal of Neuroscience Methods . 236 : 125–47 . doi :10.1016/j.jneumeth.2014.08.017. PMC 4171043. PMID 25169049  . 
  8. ^ Франк, Дж.; Биесальски, ХК; Доминичи, С.; Помпелла, А. (январь 2000 г.). «Визуализация оксидантного стресса в тканях и изолированных клетках». Гистология и гистопатология . 15 (1): 173– 184. doi :10.14670/HH-15.173. ISSN  0213-3911. PMID  10668208.
  9. ^ Киффер Т.Дж., Вольтьен К., Осафунэ К., Ябе Д., Инагаки Н. (октябрь 2017 г.). «Стратегии замены бета-клеток при диабете». Журнал исследования диабета . 9 (3): 457–463 . doi :10.1111/jdi.12758. ПМЦ 5934267 . ПМИД  28984038. 

Дальнейшее чтение

  • Выделение предсердных кардиомиоцитов: Voigt N, Pearman CM, Dobrev D, Dibb KM (сентябрь 2015 г.). «Методы выделения предсердных клеток у крупных млекопитающих и людей». Журнал молекулярной и клеточной кардиологии . 86 : 187–98 . doi : 10.1016/j.yjmcc.2015.07.006 . PMID  26186893.
  • Выделение желудочковых кардиомиоцитов: Louch WE, Sheehan KA, Wolska BM (сентябрь 2011 г.). «Методы выделения, культивирования и переноса генов кардиомиоцитов». Журнал молекулярной и клеточной кардиологии . 51 (3): 288– 98. doi :10.1016/j.yjmcc.2011.06.012. PMC 3164875. PMID  21723873 . 
  • Выделение островковых клеток поджелудочной железы: Ricordi C, Lacy PE, Finke EH, Olack BJ, Scharp DW (апрель 1988 г.). «Автоматизированный метод выделения островковых клеток поджелудочной железы человека». Диабет . 37 (4): 413–20 . doi :10.2337/diab.37.4.413. PMID  3288530. S2CID  20974701.
  • Выделение гемопоэтических стволовых клеток: Ректор К, Лю И, Ван Зант Г (2013). «Комплексные методы выделения гемопоэтических стволовых клеток». Стволовые клетки и старение . Методы в молекулярной биологии. Т. 976. С.  1– 15. doi :10.1007/978-1-62703-317-6_1. ISBN 978-1-62703-316-9. PMID  23400430.
  • Выделение мезенхимальных стволовых клеток: Yosupov N, Haimov H, Juodzbalys G (2017). «Мобилизация, выделение и характеристика стволовых клеток из периферической крови: систематический обзор». Журнал исследований полости рта и челюстно-лицевой области . 8 (1): e1. doi :10.5037/jomr.2017.8101. PMC 5423306. PMID  28496961 . 
  • Выделение звездчатых клеток печени: Shang L, Hosseini M, Liu X, Kisseleva T, Brenner DA (январь 2018 г.). «Выделение и характеристика звездчатых клеток печени человека». Журнал гастроэнтерологии . 53 (1): 6–17 . doi : 10.1007/s00535-017-1404-4 . PMID  29094206.
  • Выделение циркулирующих опухолевых клеток: Bhagwat N, Carpenter EL (2017). "Flow Cytometric Methods for Circulating Tumor Cell Isolation and Molecular Analysis". Выделение и молекулярная характеристика циркулирующих опухолевых клеток . Достижения в экспериментальной медицине и биологии. Том 994. С.  105–118 . doi :10.1007/978-3-319-55947-6_5. ISBN 978-3-319-55946-9. PMID  28560670.
  • Выделение нейроглиальных клеток: Chew LJ, DeBoy CA, Senatorov VV (октябрь 2014 г.). «Нахождение степеней разделения: экспериментальные подходы к выделению астроглиальных и олигодендроглиальных клеток и генетическому нацеливанию». Journal of Neuroscience Methods . 236 : 125–47 . doi :10.1016/j.jneumeth.2014.08.017. PMC 4171043. PMID  25169049 . 
  • Выделение уротелиальных клеток: Kloskowski T, Uzarska M, Gurtowska N, Olkowska J, Joachimiak R, Bajek A, Gagat M, Grzanka A, Bodnar M, Marszałek A, Drewa T (апрель 2014 г.). «Как выделить уротелиальные клетки? Сравнение четырех различных методов и обзор литературы». Human Cell . 27 (2): 85– 93. doi :10.1007/s13577-013-0070-y. PMID  24368576. S2CID  9966872.
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Cell_isolation&oldid=1173517854"