Разрушение клеток

Для проверки этой статьи нужны дополнительные цитаты . Помогите улучшить эту статью , добавив ссылки на надежные источники . Материалы без ссылок могут быть оспорены и удалены. Найти источники:  "Cell destruction" – новости  · газеты  · книги  · ученый  · JSTOR ( ноябрь 2008 г. ) ( Узнайте, как и когда удалять это сообщение )

Разрушение клеток , иногда называемое пищеварением , представляет собой метод или процесс высвобождения биологических молекул из клетки .

Производство биологически интересных молекул с использованием методов клонирования и культивирования позволяет изучать и производить соответствующие молекулы. За исключением выделенных молекул, клетки, производящие интересующие молекулы, должны быть разрушены. На этой странице обсуждаются различные методы. Другой метод разрушения называется cell unroofing .

Обычный лабораторный механический метод разрушения клеток использует стеклянные , керамические или стальные бусины диаметром 0,1–2 мм (0,004–0,08 дюйма), смешанные с образцом, взвешенным в водном растворе . Впервые разработанный Тимом Хопкинсом в конце 1970-х годов, образец и смесь бусинок подвергаются интенсивному перемешиванию путем перемешивания или встряхивания. Бусины сталкиваются с клеточным образцом, раскалывая клетку и высвобождая внутриклеточные компоненты . В отличие от некоторых других методов, механический сдвиг умеренный во время гомогенизации, что приводит к получению превосходных мембранных или субклеточных препаратов. Метод, часто называемый «разбиванием бусинок», хорошо подходит для всех типов клеточного материала — от спор до тканей животных и растений . Это наиболее широко используемый метод лизиса дрожжей , и он может обеспечить разрушение более 50% (до 95%). ^[1] Преимущество этого метода перед другими методами механического разрушения клеток заключается в возможности разрушения образцов очень малых размеров, одновременной обработки большого количества образцов без риска перекрестного загрязнения и в процессе не выделяются потенциально опасные аэрозоли .

В простейшем примере метода равный объем гранул добавляется к суспензии клеток или тканей в пробирке, и образец энергично перемешивается на обычном лабораторном вихревом миксере . Хотя время обработки медленное и занимает в 3–10 раз больше времени, чем в специальных встряхивающих машинах , этот метод хорошо подходит для легко разрушаемых клеток и недорог.

Успешное измельчение шариков зависит не только от конструктивных особенностей встряхивающей машины (которые учитывают частоту колебаний при встряхивании, бросок или расстояние встряхивания, ориентацию встряхивания и ориентацию флакона), но и от выбора правильного размера шариков (диаметр 0,1–6 мм (0,004–0,2 дюйма)), состава шариков (стекло, керамика, сталь) и загрузки шариков в флакон .

В большинстве лабораторий дробление шариков выполняется партиями размером от одного до двадцати четырех запечатанных пластиковых флаконов или центрифужных пробирок . Образец и мелкие шарики перемешиваются со скоростью около 2000 колебаний в минуту в специально разработанных возвратно-поступательных шейкерах, приводимых в действие мощными электродвигателями . Разрушение клеток завершается через 1–3 минуты встряхивания. Значительно более высокие скорости разрушения клеток достигаются с помощью вариации дробилки шариков под названием SoniBeast . В отличие от обычных машин, она перемешивает шарики с помощью вихревого движения со скоростью 20 000 колебаний в минуту. Более крупные машины для дробления шариков, которые удерживают микротитровальные планшеты с глубокими лунками , также сокращают время процесса, как и дозаторы шариков, предназначенные для быстрой загрузки шариков в несколько флаконов или микропланшетов. ^{[2] [3]} Также доступны предварительно загруженные флаконы и микропланшеты.

Все высокоэнергетические машины для бисерного измельчения нагревают образец примерно на 10 градусов в минуту. Это происходит из-за трения соударений бусин во время гомогенизации. Охлаждение образца во время или после бисерного измельчения может быть необходимо для предотвращения повреждения термочувствительных белков, таких как ферменты. Нагревание образца можно контролировать, бисерное измельчение в течение коротких интервалов времени с охлаждением на льду между каждым интервалом, обрабатывая флаконы в предварительно охлажденных алюминиевых держателях для флаконов или циркулируя газообразный хладагент через машину во время бисерного измельчения.

Другая конфигурация бисерного битера, подходящая для больших объемов образцов, использует вращающийся фторуглеродный ротор внутри камеры объемом 15, 50 или 200 мл для перемешивания бисеринок. В этой конфигурации камера может быть окружена статической охлаждающей рубашкой. Используя эту же конфигурацию ротора/камеры, большие коммерческие машины доступны для обработки многих литров клеточной суспензии . В настоящее время эти машины ограничены обработкой одноклеточных организмов, таких как дрожжи, водоросли и бактерии .

Образцы с жестким внеклеточным матриксом, такие как соединительная ткань животных, некоторые образцы биопсии опухолей, венозная ткань, хрящ, семена и т. д., измельчаются до состояния мелкого порошка путем ударного измельчения при температуре жидкого азота. Этот метод, известный как криоизмельчение, основан на том факте, что биологические образцы, содержащие значительную долю воды, становятся хрупкими при чрезвычайно низких температурах. Этот метод был впервые описан Смакером и Пфистером в 1975 году, которые назвали этот метод крио-импактингом. Авторы продемонстрировали, что клетки эффективно разрушаются этим методом, подтвердив с помощью фазовой и электронной микроскопии, что плоскости разрушения пересекают клеточные стенки и цитоплазматические мембраны. ^[4]

Эту технику можно реализовать, используя ступку и пестик, охлажденные до температуры жидкого азота, но использование этого классического аппарата трудоемко, и потеря образца часто является проблемой. Для этой цели также доступны специализированные пульверизаторы из нержавеющей стали, известные как пульверизаторы тканей. Они требуют меньше ручных усилий, обеспечивают хорошее извлечение образца и легко очищаются между образцами. Преимуществами этой техники являются более высокие выходы белков и нуклеиновых кислот из небольших твердых образцов тканей - особенно при использовании в качестве предварительного шага к механическим или химическим/растворительным методам разрушения клеток, упомянутым выше.

С 1940-х годов высокое давление использовалось как метод разрушения клеток, наиболее известным из которых был французский пресс для клеток под давлением , или сокращенно французский пресс. Этот метод был разработан Чарльзом Стейси Френчем и использует высокое давление для проталкивания клеток через узкое отверстие, заставляя клетки лизироваться из-за сдвигающих усилий, возникающих из-за разницы давления. ^{[5] [6]} Хотя французские прессы стали основным предметом во многих микробиологических лабораториях, их производство было в значительной степени прекращено, что привело к возрождению альтернативных применений аналогичной технологии.

Современные физические клеточные дезинтеграторы обычно работают либо с помощью пневматического, либо гидравлического давления. Хотя пневматические машины обычно менее дороги, их производительность может быть ненадежной из-за колебаний давления обработки на протяжении всего хода воздушного насоса. Обычно считается, что гидравлические машины обеспечивают превосходную лизирующую способность, особенно при обработке более сложных для разрушения образцов, таких как дрожжи или грамположительные бактерии , из-за их способности поддерживать постоянное давление на протяжении всего хода поршня. Поскольку французский пресс, который работает с помощью гидравлического давления, способен лизисировать более 90% наиболее часто используемых типов клеток, его часто принимают за золотой стандарт производительности лизиса, и современные машины часто сравнивают с ним не только с точки зрения эффективности лизиса, но и с точки зрения безопасности и простоты использования. Некоторые производители также пытаются улучшить традиционную конструкцию, изменяя свойства в этих машинах, отличные от давления, проталкивающего образец через отверстие. Одним из таких примеров является Constant Systems, которая недавно показала, что их клеточные дезинтеграторы не только соответствуют производительности традиционного французского пресса, но и стремятся достичь тех же результатов при гораздо меньшей мощности. ^[7]

Технология циклического давления («PCT»). PCT — это запатентованная, обеспечивающая технологическая платформа, которая использует чередующиеся циклы гидростатического давления между окружающим и сверхвысоким уровнем (до 90 000 фунтов на кв. дюйм) для безопасного, удобного и воспроизводимого управления действиями молекул в биологических образцах, например, разрывом (лизисом) клеток и тканей из человеческих, животных, растительных и микробных источников, а также инактивацией патогенов. Системы, улучшенные PCT (инструменты и расходные материалы), решают некоторые сложные проблемы, присущие подготовке биологических образцов. Преимущества PCT включают: (a) извлечение и восстановление большего количества мембранных белков, (b) улучшенное переваривание белков, (c) дифференциальный лизис в смешанной базе образцов, (d) инактивация патогенов, (e) повышенное обнаружение ДНК и (f) точный контроль процесса подготовки образцов. ^[8]

Метод Microfluidizer, используемый для разрушения клеток, сильно влияет на физико-химические свойства лизированной клеточной суспензии, такие как размер частиц, вязкость, выход белка и активность ферментов. В последние годы метод Microfluidizer приобрел популярность в разрушении клеток из-за его простоты использования и эффективности при разрушении многих различных типов клеток. Технология Microfluidizer была лицензирована у компании Arthur D. Little и впервые была разработана и использована в 1980-х годах, изначально как инструмент для создания липосом . С тех пор она использовалась в других приложениях, таких как наноэмульсии для разрушения клеток и уменьшение размера твердых частиц, среди прочего.

Используя микроканалы с фиксированной геометрией и насос-усилитель, генерируются высокие скорости сдвига , которые разрывают клетки. Этот метод лизиса клеток может привести к разрушению более 90% клеток E. coli. ^[9]

Многие белки чрезвычайно чувствительны к температуре и во многих случаях могут начать денатурировать при температуре всего 4 градуса Цельсия. Внутри микроканалов температура превышает 4 градуса Цельсия, но машина разработана для быстрого охлаждения, так что время, в течение которого клетки подвергаются воздействию повышенных температур, чрезвычайно коротко ( время пребывания 25 мс-40 мс). Благодаря этому эффективному контролю температуры, микрофлюидизатор обеспечивает более высокие уровни активных белков и ферментов, чем другие механические методы, когда белки чувствительны к температуре. ^[10]

Изменения вязкости также часто наблюдаются при разрушении клеток. Если вязкость клеточной суспензии высокая, это может значительно затруднить последующую обработку, например фильтрацию и точное пипетирование. Изменения вязкости, наблюдаемые с помощью микрофлюидизатора, относительно невелики и уменьшаются при дальнейших дополнительных проходах через машину. ^[11]

В отличие от других методов механического разрушения, Microfluidizer эффективно, но мягко разрушает клеточные мембраны, что приводит к относительно большим фрагментам клеточной стенки (450 нм) и, таким образом, облегчает разделение содержимого клеток. Это может привести к сокращению времени фильтрации и лучшему разделению центрифугированием. ^[12]

Технология микрофлюидизации масштабируется от одного миллилитра до тысяч литров.

Для азотной декомпрессии большие количества азота сначала растворяются в клетке под высоким давлением в подходящем сосуде . Затем, когда давление газа внезапно сбрасывается, азот выходит из раствора в виде расширяющихся пузырьков, которые растягивают мембраны каждой клетки, пока они не разорвутся и не высвободят содержимое клетки.

Декомпрессия азота более щадящая для ферментов и органелл , чем ультразвуковые и механические методы гомогенизации, и выгодно отличается от контролируемого разрушающего действия, получаемого в ПТФЭ и стеклянной ступке и пестик-гомогенизаторе. ^[13] В то время как другие разрушающие методы зависят от трения или механического сдвигающего действия, которые генерируют тепло, процедура декомпрессии азота сопровождается адиабатическим расширением, которое охлаждает образец, а не нагревает его.

Подушка из инертного азотного газа, которая насыщает клеточную суспензию и гомогенат, обеспечивает защиту от окисления клеточных компонентов. Хотя в этой технике использовались и другие газы: углекислый газ , закись азота , окись углерода и сжатый воздух, азот предпочтительнее из-за его нереактивной природы и из-за того, что он не изменяет pH суспензионной среды. Кроме того, азот предпочтительнее, поскольку он обычно доступен по низкой цене и при давлениях, подходящих для этой процедуры.

После высвобождения субклеточные вещества не подвергаются постоянному истиранию , которое может денатурировать образец или вызвать нежелательные повреждения. Нет необходимости следить за пиком между активностью фермента и процентом разрушения. Поскольку пузырьки азота генерируются внутри каждой клетки, одна и та же разрушающая сила применяется равномерно по всему образцу, тем самым обеспечивая необычную однородность продукта. Могут быть получены бесклеточные гомогенаты.

Эта технология используется для гомогенизации клеток и тканей, высвобождения неповрежденных органелл , подготовки клеточных мембран , высвобождения лабильных биохимических веществ и получения однородных и воспроизводимых гомогенатов, не подвергая образец экстремальному химическому или физическому воздействию.

Этот метод особенно хорошо подходит для обработки клеток млекопитающих и других мембраносвязанных клеток. ^[14] Он также успешно использовался для обработки растительных клеток , для высвобождения вируса из оплодотворенных яиц и для обработки хрупких бактерий . Он не рекомендуется для необработанных бактериальных клеток. Дрожжи , грибки , споры и другие материалы с жесткими клеточными стенками плохо реагируют на этот метод.

• Лизис
• Ультразвуковой гомогенизатор
• Соникация
• Гомогенизация (химия)
• Гомогенизатор