Полимеразная цепная реакция с переключением матрицы

Полимеразная цепная реакция с переключением матрицы ( TS-PCR ) — это метод обратной транскрипции и амплификации полимеразной цепной реакции (ПЦР), который основан на естественной последовательности праймера ПЦР на участке полиаденилирования , также известном как поли(А)-хвост, и добавляет второй праймер посредством активности обратной транскриптазы вируса лейкемии мышей . ^[1] Это позволяет считывать полные последовательности кДНК и может обеспечить высокий выход из отдельных источников, даже отдельных клеток, которые содержат от 10 до 30 пикограмм мРНК , с относительно низкими уровнями (3-5%) загрязняющей последовательности рРНК . Этот метод часто используется при секвенировании методом дробовика всего транскриптома . Он продается Clontech как механизм переключения на 5'-конце шаблона РНК ( SMART ) ^[2]^[3], а также Diagenode как захват и амплификация с помощью хвоста и переключения ( CATS ).

Drop-Seq

Используя шприцевые насосы для передачи постоянной скорости изолированных клеток и уникальных олигонуклеотидных штрих-кодированных шариков, можно изолировать отдельные клетки и шарики вместе в каплях буфера лизиса, где сайт полиаденилирования связывается с праймером, содержащим уникальную идентифицирующую последовательность. ^[4] Этот праймер также содержит общую последовательность выше идентификатора, так что после его расширения с помощью обратной транскрипции последующие раунды ПЦР будут включать метку, которая позволяет отслеживать каждую изолированную секвенированную кДНК обратно до определенной исходной бусины. Это позволяет одновременно анализировать относительные уровни транскриптов во многих отдельных клетках, создавая рациональную основу для классификации этих клеток в определенные типы клеток , ^[5] или позволяя логически вывести данные гибридизации in situ из эмбрионов без фактического проведения эксперимента. ^[6]

Ссылки

^ L. Petalidis; S. Bhattacharyya; GA Morris; VP Collins; TC Freeman; PA Lyons (2003-11-15). "Глобальная амплификация мРНК с помощью ПЦР с переключением шаблонов: линейность и применение к анализу микрочипов". Nucleic Acids Research . 31 (22): e142. doi :10.1093/nar/gng142. PMC 275579. PMID 14602935 .
^ «Транскриптомный анализ отдельных клеток, реализованный с помощью технологии SMARTer». Clontech.
^ Zhu YY, Machleder EM, Chenchik A, Li R, Siebert PD (апрель 2001 г.). «Переключение шаблона обратной транскриптазы: подход SMART для построения полноразмерной библиотеки кДНК». BioTechniques . 30 (4): 892– 7. doi : 10.2144/01304pf02 . PMID 11314272.
^ Стив МакКэрролл. «Лаборатория МакКэрролла». Гарвард.(включает обновленный протокол, ссылку на публикацию, программное обеспечение и наборы данных)
^ Эмили Андервуд (2015-08-07). «Кризис идентичности мозга». Science . 349 (6248): 575– 577. doi : 10.1126/science.349.6248.575 . PMID 26250665.
^ Рахул Сатиджа; Джеффри А. Фаррелл; Дэвид Дженнерт; Александр Ф. Шир; Авив Регев1 (2015). «Пространственная реконструкция данных по экспрессии генов в отдельных клетках». Nature Biotechnology . 33 (5): 495– 502. doi :10.1038/nbt.3192. PMC 4430369 . PMID 25867923. {{cite journal}}: CS1 maint: числовые имена: список авторов ( ссылка )

Эта статья по молекулярной биологии — заглушка . Вы можете помочь Википедии, расширив ее.

[1] L. Petalidis; S. Bhattacharyya; GA Morris; VP Collins; TC Freeman; PA Lyons (2003-11-15). "Глобальная амплификация мРНК с помощью ПЦР с переключением шаблонов: линейность и применение к анализу микрочипов". Nucleic Acids Research . 31 (22): e142. doi :10.1093/nar/gng142. PMC 275579. PMID 14602935 .

[2] «Транскриптомный анализ отдельных клеток, реализованный с помощью технологии SMARTer». Clontech.

[3] Zhu YY, Machleder EM, Chenchik A, Li R, Siebert PD (апрель 2001 г.). «Переключение шаблона обратной транскриптазы: подход SMART для построения полноразмерной библиотеки кДНК». BioTechniques . 30 (4): 892– 7. doi : 10.2144/01304pf02 . PMID 11314272.

[4] Стив МакКэрролл. «Лаборатория МакКэрролла». Гарвард.(включает обновленный протокол, ссылку на публикацию, программное обеспечение и наборы данных)

[5] Эмили Андервуд (2015-08-07). «Кризис идентичности мозга». Science . 349 (6248): 575– 577. doi : 10.1126/science.349.6248.575 . PMID 26250665.

[6] Рахул Сатиджа; Джеффри А. Фаррелл; Дэвид Дженнерт; Александр Ф. Шир; Авив Регев1 (2015). «Пространственная реконструкция данных по экспрессии генов в отдельных клетках». Nature Biotechnology . 33 (5): 495– 502. doi :10.1038/nbt.3192. PMC 4430369 . PMID 25867923. {{cite journal}}: CS1 maint: числовые имена: список авторов ( ссылка )