Анализ белка по Брэдфорду
Метод определения концентрации белка

Анализ белка Брэдфорда (также известный как анализ белка Кумасси) был разработан Мэрион М. Брэдфорд в 1976 году. [1] Это быстрая и точная [2] спектроскопическая аналитическая процедура, используемая для измерения концентрации белка в растворе. Реакция зависит от аминокислотного состава измеряемых белков.

Принцип

Рисунок 1. Кумасси бриллиантовый синий G-250, связующий краситель для метода Брэдфорда.
Цветная реакция белка и реагента Брэдфорда

Анализ Брэдфорда, колориметрический анализ белка , основан на сдвиге поглощения красителя Кумасси бриллиантовый синий G-250 . Краситель Кумасси бриллиантовый синий G-250 существует в трех формах: анионной (синей), нейтральной (зеленой) и катионной (красной). [3] В кислых условиях красная форма красителя преобразуется в синюю форму, связываясь с анализируемым белком. Если нет белка для связывания, то раствор останется коричневым. Краситель образует прочный нековалентный комплекс с карбоксильной группой белка посредством сил Ван-дер-Ваальса и аминогруппой посредством электростатических взаимодействий. [1] Во время образования этого комплекса красная форма красителя Кумасси сначала отдает свой свободный электрон ионизуемым группам на белке, что вызывает нарушение нативного состояния белка, в результате чего обнажаются его гидрофобные карманы. Эти карманы в третичной структуре белка нековалентно связываются с неполярной областью красителя посредством первого взаимодействия связи ( силы Ван-дер-Ваальса ), которые располагают положительные аминогруппы в непосредственной близости от отрицательного заряда красителя. Связь дополнительно усиливается вторым взаимодействием связи между ними, ионным взаимодействием. Когда краситель связывается с белком, он вызывает сдвиг с 465 нм до 595 нм, поэтому показания поглощения снимаются при 595 нм. [4]

Катионная (несвязанная) форма имеет зеленый / красный цвет и имеет спектр поглощения , максимум которого исторически считался равным 465 нм . Анионная связанная форма красителя, которая удерживается вместе гидрофобными и ионными взаимодействиями, имеет спектр поглощения, максимум которого исторически считался равным 595 нм . [5] Увеличение поглощения при 595 нм пропорционально количеству связанного красителя и, следовательно, количеству (концентрации) белка, присутствующего в образце. [6]

В отличие от других анализов белка, анализ белка Брэдфорда менее восприимчив к помехам со стороны различных химических соединений, таких как натрий, калий или даже углеводы, такие как сахароза, которые могут присутствовать в образцах белка. [2] Исключением являются повышенные концентрации детергента . Додецилсульфат натрия (SDS), распространенный детергент, может быть обнаружен в экстрактах белка, поскольку он используется для лизиса клеток путем разрушения липидного бислоя мембраны и для денатурации белков для SDS-PAGE . В то время как другие детергенты мешают анализу при высокой концентрации, помехи, вызванные SDS, имеют два различных режима, и каждый происходит при разной концентрации. Когда концентрации SDS ниже критической концентрации мицелл (известной как ККМ, 0,00333%W/V до 0,0667%) в растворе красителя Кумасси, детергент имеет тенденцию прочно связываться с белком, ингибируя сайты связывания белка для реагента красителя. Это может привести к недооценке концентрации белка в растворе. Когда концентрации SDS выше CMC, детергент прочно связывается с зеленой формой красителя Кумасси, вызывая смещение равновесия, тем самым производя больше синей формы. Это вызывает увеличение поглощения при 595 нм независимо от присутствия белка. [6]

Другие помехи могут исходить от буфера, используемого при подготовке образца белка. Высокая концентрация буфера приведет к завышенной оценке концентрации белка из-за истощения свободных протонов из раствора сопряженным основанием из буфера. Это не будет проблемой, если используется низкая концентрация белка (впоследствии буфер). [6]

Для измерения поглощения бесцветного соединения необходимо провести анализ Брэдфорда. Некоторые бесцветные соединения, такие как белки, могут быть количественно определены при оптической плотности 280 нм из-за присутствия ароматических колец, таких как триптофан, тирозин и фенилаланин, но если ни одна из этих аминокислот не присутствует, поглощение невозможно измерить при 280 нм. [7]

Преимущества

Многие растворы, содержащие белок, имеют самое высокое поглощение при 280 нм в спектрофотометре, УФ-диапазоне. Для этого требуются спектрофотометры, способные проводить измерения в УФ-диапазоне, чего многие не могут. Кроме того, максимум поглощения при 280 нм требует, чтобы белки содержали ароматические аминокислоты, такие как тирозин (Y), фенилаланин (F) и/или триптофан (W). Не все белки содержат эти аминокислоты, что искажает результаты измерений концентрации. Если в образце присутствуют нуклеиновые кислоты, они также будут поглощать свет при 280 нм, еще больше искажая результаты. Используя анализ белка Брэдфорда, можно избежать всех этих осложнений, просто смешав образцы белка с красителем Кумасси бриллиантовый синий G-250 (реагент Брэдфорда) и измерив их поглощение при 595 нм, что находится в видимом диапазоне [8] и может быть точно измерено с помощью камеры мобильного смартфона. [9]

Процедура анализа белка Брэдфорда очень проста и понятна. Она выполняется в один этап, когда реагент Брэдфорда добавляется в пробирку вместе с образцом. После тщательного перемешивания смесь почти сразу же меняет цвет на синий. Когда краситель связывается с белками в процессе, который занимает около 2 минут, происходит изменение максимума поглощения красителя с 465 нм до 595 нм в кислых растворах. [2] Кроме того, связывание белка запускает метахроматическую реакцию, о чем свидетельствует появление вида, который поглощает свет около 595 нм, что указывает на непротонированную форму [10] Этот краситель создает прочные нековалентные связи с белками посредством электростатических взаимодействий с амино- и карбоксильными группами, а также взаимодействий Ван-дер-Ваальса. Только молекулы, которые связываются с белками в растворе, демонстрируют это изменение поглощения, что устраняет опасения, что несвязанные молекулы красителя могут вносить вклад в экспериментально полученные показания поглощения. Этот процесс более выгоден, поскольку он менее затратен, чем другие методы, прост в использовании и имеет высокую чувствительность красителя к белку. [11]

Через 5 минут инкубации поглощение можно измерить при 595 нм с помощью спектрофотометра или камеры мобильного смартфона (метод RGBradford). [9]

Этот анализ является одним из самых быстрых анализов, проводимых с белками. [12] Общее время, необходимое для подготовки и проведения анализа, составляет менее 30 минут. [13] Весь эксперимент проводится при комнатной температуре.

Анализ белка по Брэдфорду позволяет измерять количество белка от 1 до 20 мкг. [14] Это чрезвычайно чувствительный метод.

Реагент-краситель — это стабильный готовый к использованию продукт, приготовленный в фосфорной кислоте . Он может оставаться при комнатной температуре до 2 недель, прежде чем начнет разлагаться.

Образцы белка обычно содержат соли, растворители, буферы, консерванты, восстановители и хелатирующие агенты металлов. Эти молекулы часто используются для солюбилизации и стабилизации белков. Другие анализы белка, такие как BCA и Lowry, неэффективны, поскольку молекулы, подобные восстановителям, мешают анализу. [15] Использование метода Брэдфорда может быть выгодным против этих молекул, поскольку они совместимы друг с другом и не будут мешать. [16]

Линейный график, полученный в результате анализа (поглощение в зависимости от концентрации белка в мкг/мл), можно легко экстраполировать для определения концентрации белков, используя наклон линии.

Это чувствительная техника. Она также очень проста: измерение OD при 595 нм после 5 минут инкубации. Этот метод также может использовать спектрофотометр Vis [17] или камеру мобильного смартфона (метод RGBradford). [9]

Недостатки

Анализ Брэдфорда линеен в коротком диапазоне, обычно от 0 мкг/мл до 2000 мкг/мл, что часто приводит к необходимости разбавления образца перед анализом. При выполнении этих разведений ошибка в одном разбавлении усугубляется в дальнейших разбавлениях, что приводит к линейной зависимости, которая не всегда может быть точной.

Основные условия и детергенты, такие как SDS, могут влиять на способность красителя связываться с белком через его боковые цепи. [12]

Реагенты в этом методе имеют тенденцию окрашивать пробирки. Нельзя использовать одни и те же пробирки, так как пятно повлияет на показания поглощения. Этот метод также чувствителен ко времени. Когда тестируется более одного раствора, важно убедиться, что каждый образец инкубируется в течение одинакового количества времени для точного сравнения. [18]

Ограничивающим фактором при использовании красителей для определения белка на основе Кумасси является значительная вариация цветового выхода, наблюдаемая для разных белков [19]. Этот ограничивающий фактор особенно очевиден в образцах белка, богатых коллагеном, таких как экстракты поджелудочной железы, где и методы Лоури, и методы Брэдфорда, как правило, занижают содержание белка.

Его также подавляет присутствие детергентов, хотя эту проблему можно решить, добавив циклодекстрины в смесь для анализа. [20]

Большая часть нелинейности возникает из-за равновесия между двумя различными формами красителя, которое нарушается добавлением белка. Анализ Брэдфорда линеаризуется путем измерения отношения поглощений, 595 на 450 нм. Этот модифицированный анализ Брэдфорда примерно в 10 раз более чувствителен, чем обычный. [21]

Краситель Coomassie Blue G250, используемый для связывания с белками в оригинальном методе Брэдфорда, легко связывается с аргининовыми и лизиновыми группами белков. Это недостаток, поскольку предпочтение красителя связываться с этими аминокислотами может привести к различной реакции анализа между различными белками. Для исправления этой вариации были внесены изменения в оригинальный метод, такие как повышение pH путем добавления NaOH или добавления большего количества красителя. Хотя эти модификации приводят к менее чувствительному анализу, модифицированный метод становится чувствительным к детергентам, которые могут мешать образцу. [22]

Будущее анализа белка по Брэдфорду

В настоящее время ведутся работы по новым модификациям для улучшенного анализа белка Брэдфорда, которые специально фокусируются на повышении точности обнаружения коллагеновых белков. Одна из заметных модификаций включает включение небольших количеств, приблизительно 0,0035%, додецилсульфата натрия (SDS). Было показано, что включение SDS приводит к четырехкратному увеличению цветового отклика для трех ключевых коллагеновых белков — коллагенов типов I, III и IV — при одновременном снижении поглощения неколлагеновых белков. [19]

Эта простая модификация в приготовлении реагента привела к тому, что анализы Брэдфорда стали давать схожие кривые отклика как для коллагеновых, так и для неколлагеновых белков, что расширило возможности использования анализов Брэдфорда в образцах, содержащих белки с высоким содержанием коллагена.

Образец процедуры Брэдфорда

Материалы

  • Лиофилизированный бычий плазматический гамма-глобулин
  • Кумасси бриллиантовый синий 1
  • 0,15 М NaCl
  • Спектрофотометр и кюветы или камера мобильного смартфона (метод RGBradford). [9]
  • Микропипетки

Процедура (стандартный анализ, 20–150 мкг белка; 200–1500 мкг/мл)

  1. Подготовьте ряд стандартов, разбавленных 0,15 М NaCl до конечных концентраций 0 (пусто = нет белка), 250, 500, 750 и 1500 мкг/мл. Также подготовьте серийные разбавления неизвестного образца для измерения.
  2. Добавьте по 100 мкл каждого из вышеперечисленных веществ в отдельную пробирку (или пробирку спектрофотометра, если используете Spectronic 20 ).
  3. Добавьте в каждую пробирку по 5,0 мл Кумасси синего и перемешайте методом вортекса или переворачивания.
  4. Настройте спектрофотометр на длину волны 595 нм, используя пробирку, не содержащую белка (пустую).
  5. Подождите 5 минут и считайте результаты каждого стандарта и каждого образца при длине волны 595 нм.
  6. Постройте график зависимости поглощения стандартов от их концентрации. Вычислите коэффициент экстинкции и рассчитайте концентрации неизвестных образцов.

Процедура (микроанализ, 1-10 мкг белка/мл)

  1. Подготовьте стандартные концентрации белка 1, 5, 7,5 и 10 мкг/мл. Подготовьте бланк только NaCl. Подготовьте серию разведений образца.
  2. Добавьте по 100 мкл каждого из вышеперечисленных веществ в отдельные пробирки (используйте микроцентрифужные пробирки) и добавьте в каждую пробирку по 1,0 мл Кумасси синего.
  3. Включите и настройте спектрофотометр на длину волны 595 нм и очистите спектрофотометр с помощью кювет объемом 1,5 мл или используйте камеру мобильного смартфона (метод RGBradford). [9]
  4. Подождите 2 минуты и измерьте поглощение каждого стандарта и образца при 595 нм.
  5. Постройте график зависимости поглощения стандартов от их концентрации. Вычислите коэффициент экстинкции и рассчитайте концентрации неизвестных образцов.

Используя полученные данные, найдите концентрацию неизвестного

Подводя итог, для того, чтобы найти стандартную кривую, необходимо использовать различные концентрации BSA ( бычий сывороточный альбумин ) [2] , чтобы создать стандартную кривую с концентрацией, нанесенной на ось x, и поглощением, нанесенным на ось y. Для создания точной стандартной кривой используется только узкая концентрация BSA (2-10 мкг/мл). [23] Использование широкого диапазона концентраций белка затруднит определение концентрации неизвестного белка. Затем эта стандартная кривая используется для определения концентрации неизвестного белка. Далее подробно описывается, как перейти от стандартной кривой к концентрации неизвестного белка.

Сначала добавьте линию наилучшего соответствия или линейную регрессию и отобразите уравнение на графике. В идеале значение R 2 будет как можно ближе к 1. R представляет собой сумму квадратных значений соответствия, вычтенных из каждой точки данных. Поэтому, если R 2 намного меньше единицы, рассмотрите возможность повторного проведения эксперимента, чтобы получить его с более надежными данными. [24]

График 1. Фактические данные BSA, полученные с помощью микромасштабного УФ-видимого спектрофотометра

Уравнение, отображенное на диаграмме, дает способ расчета поглощения и, следовательно, концентрации неизвестных образцов. На диаграмме 1 x — концентрация, а y — поглощение, поэтому необходимо переставить уравнение для решения относительно x и ввести поглощение измеренного неизвестного. [25] Вероятно, что неизвестное будет иметь значения поглощения за пределами диапазона стандарта. Они не должны быть включены в расчеты, поскольку приведенное уравнение не может применяться к числам за пределами его ограничений. В большом масштабе необходимо вычислить коэффициент экстинкции, используя закон Бера-Ламберта A=εLC, в котором A — измеренное поглощение, ε — наклон стандартной кривой, L — длина кюветы, а C — определяемая концентрация. [26] В микромасштабе кювета может не использоваться, поэтому необходимо переставить только для решения относительно x.

Таблица 1. Фактические данные анализа для определения концентрации неизвестного вещества на основе линии наилучшего соответствия приведенной выше стандартной кривой.

Чтобы достичь концентрации, которая имеет смысл с данными, разбавления, концентрации и единицы неизвестного должны быть нормализованы (таблица 1). Для этого необходимо разделить концентрацию на объем белка, чтобы нормализовать концентрацию, и умножить на количество разбавленного, чтобы скорректировать любое разбавление, сделанное в белке перед выполнением анализа.

Альтернативные анализы

Альтернативные анализы белков включают:

Ссылки

  1. ^ ab Ninfa, Alexander J; Ballou, David P; Benore, Marilee (2008). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии . Wiley. стр. 113.
  2. ^ abcd Брэдфорд, Мэрион (1976). «Быстрый и чувствительный метод количественного определения микрограммовых количеств белка с использованием принципа связывания белка с красителем» (PDF) . Аналитическая биохимия . 72 (1–2): 248–254. doi :10.1006/abio.1976.9999. PMID  942051 – через Google Scholar.
  3. ^ "Quick Start TM Bradford Protein Assay" (PDF) . www.bio-rad.com .
  4. ^ Брэдфорд, Мэрион М. (май 1976 г.). «Быстрый и чувствительный метод количественного определения микрограммовых количеств белка с использованием принципа связывания белка с красителем». Аналитическая биохимия . 72 (1–2): 248–254. doi :10.1006/abio.1976.9999. PMID  942051.
  5. ^ «Определение белка методом Брэдфорда».
  6. ^ abc Кругер, Николас Дж. (2009), Уокер, Джон М. (ред.), «Метод Брэдфорда для количественного определения белка», Справочник по белковым протоколам , Справочники по протоколам Springer, Тотова, Нью-Джерси: Humana Press, стр. 17–24, doi : 10.1007/978-1-59745-198-7_4, ISBN 978-1-60327-474-6, получено 2022-06-27
  7. ^ P., Ballou, David; Marilee., Benore (2010). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии . John Wiley. ISBN 9780470087664. OCLC  420027217.{{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  8. ^ Ninfa, Ballou, Benore, Alexander J., David P., Marilee (2010). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии . Соединенные Штаты Америки: John Wiley & Sons, Inc. стр. 110, 113. ISBN 978-0-470-08766-4.{{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  9. ^ abcde Moreira, Daniel C. (октябрь 2022 г.). "RGBradford: Точное измерение концентрации белка с использованием камеры смартфона и соотношения интенсивности синего и зеленого". Аналитическая биохимия . 655 : 114839. doi : 10.1016/j.ab.2022.114839. PMID  35987416. S2CID  251684735.
  10. ^ Сапан, Кристин В.; Лундблад, Роджер Л.; Прайс, Николас К. (апрель 1999 г.). «Колориметрические методы анализа белков». Биотехнология и прикладная биохимия . 29 (2): 99–108. doi :10.1111/j.1470-8744.1999.tb00538.x. ISSN  0885-4513. PMID  10075906.
  11. ^ Нинфа, Александр Дж.; Баллу, Дэвид П.; Бенор, Мэрили (2010). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии . John Wiley & Sons Inc. стр. 113. ISBN 978-0470087664.
  12. ^ ab Okutucu, Burcu; Dınçer, Ayşşe; Habib, Ömer; Zıhnıoglu, Figen (2007-08-01). "Сравнение пяти методов определения общей концентрации белка в плазме". Журнал биохимических и биофизических методов . 70 (5): 709–711. doi :10.1016/j.jbbm.2007.05.009. PMID  17597224.
  13. ^ «Техническое руководство по анализу белков» (PDF) .
  14. ^ "4.5. Определение концентрации белка". elte.prompt.hu . Архивировано из оригинала 2016-09-21 . Получено 2016-05-19 .
  15. ^ barbosa, Helder; Slater KH, Nigel (3 августа 2009 г.). «Количественное определение белка в присутствии полиэтиленгликоля и декстрана с использованием метода Брэдфорда». Аналитическая биохимия . 395 (1): 108–110. doi :10.1016/j.ab.2009.07.045. PMID  19653991.
  16. ^ Нинфа, Александр Дж. (2010). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии . Wiley. С. 117–118. ISBN 978-0470087664.
  17. ^ Нинфа, Баллу (1998). Фундаментальные подходы к биохимии и биотехнологии . Fitzgerald Science Press, Бетесда, Мэриленд. С. 114–116. ISBN 978-0470087664.
  18. ^ Нинфа, Александр Дж.; Баллу, Дэвид П.; Беноре, Мэрили (2009). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии . Wiley. стр. 113.
  19. ^ Аб Лопес, Хосе Мануэль; Империал, Сантьяго; Вальдеррама, Родриго; Наварро, Сальвадор (29 октября 1993 г.). «Улучшенный анализ белка Брэдфорда на белки коллагена». Клиника Химика Акта . 220 (1): 91–100. дои : 10.1016/0009-8981(93)90009-С. ISSN  0009-8981. ПМИД  8287563.
  20. ^ Рабийо, Тьерри (2018). «Оптимизация анализа cydex blue: одношаговый колориметрический анализ белка с использованием циклодекстринов, совместимый с детергентами и восстановителями». PLOS ONE . 13 (4): e0195755. Bibcode : 2018PLoSO..1395755R. doi : 10.1371 /journal.pone.0195755 . PMC 5895047. PMID  29641569. 
  21. ^ Зор, Цаффрир; Селингер, Цви (1996-05-01). «Линеаризация анализа белка Брэдфорда увеличивает его чувствительность: теоретические и экспериментальные исследования». Аналитическая биохимия . 236 (2): 302–308. doi :10.1006/abio.1996.0171. PMID  8660509.
  22. ^ Кругер, Николас Дж. (2002). «Метод Брэдфорда для количественного определения белка». Справочник по белковым протоколам, стр. 15–22. doi :10.1385/1-59259-169-8:15. ISBN 1-59259-169-8.
  23. ^ «Линеаризация анализа белка Брэдфорда увеличивает его чувствительность: теоретические и экспериментальные исследования» (PDF) . www.tau.ac . 20 ноября 1995 г.
  24. ^ Олбрайт, Брайан (2009). Математическое моделирование в Excel . Jones & Bartlett Learning. стр. 60. ISBN 978-0763765668.
  25. ^ Стивенсон, Фрэнк Гарольд (2003). Расчеты для молекулярной биологии и биотехнологии: руководство по математике в лаборатории . Academic Press. стр. 252. ISBN 978-0126657517.
  26. ^ Ибаньес, Хорхе Г. (2007). Химия окружающей среды: основы . стр. 60. ISBN 978-0387260617.

Дальнейшее чтение

  • Брэдфорд, ММ (1976), «Быстрый и чувствительный метод количественного определения микрограммовых количеств белка с использованием принципа связывания белка с красителем», Anal. Biochem. , 72 (1–2): 248–254, doi :10.1016/0003-2697(76)90527-3, PMID  942051, S2CID  4359292
  • Зор, Т.; Селингер, З. (1996), «Линеаризация анализа белка Брэдфорда повышает его чувствительность: теоретические и экспериментальные исследования», Anal. Biochem. , 236 (2): 302–308, doi :10.1006/abio.1996.0171, PMID  8660509
  • Noble, James E.; Bailey, Marc JA (2009). "Глава 8 Количественное определение белка". Руководство по очистке белка, 2-е издание . Методы в энзимологии. Том 463. С. 73–95. doi :10.1016/S0076-6879(09)63008-1. ISBN 9780123745361. PMID  19892168.
  • Олбрайт, Брайан (2009), Математическое моделирование в Excel , Jones & Bartlett Learning, стр. 60, ISBN 978-0763765668
  • Стивенсон, Фрэнк Гарольд (2003), Расчеты для молекулярной биологии и биотехнологии: руководство по математике в лаборатории , Academic Press, стр. 252, ISBN 978-0126657517
  • Деннисон, К. (2013). Руководство по выделению белка . Springer Science & Business Media. стр. 39. ISBN 978-94-017-0269-0.
  • Ибаньес, Хорхе Г. (2007), Химия окружающей среды: основы , стр. 60, ISBN 978-0387260617
  • Химия анализа Брэдфорда
  • Спектроскопия с переменной длиной пути
  • OpenWetWare
Получено с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Bradford_protein_assay&oldid=1250798373"