БиоБрик

Части BioBrick представляют собой последовательности ДНК , которые соответствуют стандарту сборки ферментов рестрикции . ^{[1] [2]} Эти строительные блоки используются для проектирования и сборки более крупных синтетических биологических цепей из отдельных частей и комбинаций частей с определенными функциями, которые затем будут включены в живые клетки, такие как клетки Escherichia coli, для построения новых биологических систем. ^[3] Примерами частей BioBrick являются промоторы , сайты связывания рибосом (RBS) , кодирующие последовательности и терминаторы .

Детали BioBrick используются с применением инженерных принципов абстракции и модуляризации. Детали BioBrick формируют основу иерархической системы, на которой базируется синтетическая биология . Существует три уровня иерархии:

1. Части: Фрагменты ДНК, которые образуют функциональную единицу (например, промотор, RBS и т. д.)
2. Устройство: Набор деталей с определенной функцией. Проще говоря, набор взаимодополняющих деталей BioBrick, собранных вместе, образует устройство.
3. Система: совокупность устройств, выполняющих высокоуровневые задачи.

Разработка стандартизированных биологических частей позволяет быстро собирать последовательности. Возможность тестирования отдельных частей и устройств для независимого тестирования и характеристики также повышает надежность систем более высокого порядка. ^[2]

Первая попытка создать список стандартных биологических частей была предпринята в 1996 году Ребачуком и др . Эта группа представила стратегию клонирования для сборки коротких фрагментов ДНК. Однако эта ранняя попытка не получила широкого признания в научно-исследовательском сообществе в то время. ^{[2] [4]} В 1999 году Аркин и Энди поняли, что гетерогенные элементы, составляющие генетическую цепь, не имеют стандартов, поэтому они предложили список стандартных биологических частей. ^[5] BioBricks были описаны и представлены Томом Найтом в Массачусетском технологическом институте в 2003 году. ^[1] С тех пор различные исследовательские группы использовали стандартные части BioBrick для проектирования новых биологических устройств и систем.

BioBricks Foundation был создан в 2006 году инженерами и учеными как некоммерческая организация для стандартизации биологических деталей в этой области. ^[6] Фонд фокусируется на совершенствовании в областях технологий, права, образования и мирового сообщества в их применении к синтетической биологии . Деятельность BioBricks Foundation включает проведение конференций SBx.0, технических и образовательных программ. Конференции SBx.0 — это международные конференции по синтетической биологии, проводимые по всему миру. Технические программы направлены на производство серии стандартных биологических деталей, а их образовательное расширение создает акты, которые помогают создавать открытые стандартизированные источники биологических деталей. ^[7]

В качестве альтернативы традиционным системам патентования биотехнологий и в попытке разрешить использование BioBricks в качестве стандарта сообщества с открытым исходным кодом, BioBricks Foundation создал Публичное соглашение BioBrick, которое состоит из Соглашения участника и Пользовательского соглашения. Те, кто хочет предоставить часть сообществу, подписывают Соглашение участника, соглашаясь не заявлять против пользователей права интеллектуальной собственности, принадлежащие участникам, которые могут ограничить использование предоставленных материалов. Подписавшие Пользовательское соглашение могут свободно использовать всю коллекцию частей, предоставленных участниками. Нет необходимости, чтобы пользователи вносили вклад в сообщество, чтобы использовать части, и пользователи могут заявлять права интеллектуальной собственности на изобретения, разработанные с использованием частей. ^[8] Пользовательское соглашение позволяет пользователям устанавливать изобретения использования частей, раскрывать патенты на комбинации частей и свободно основываться на вкладах других пользователей. ^{[9] [10]}

Стандарт сборки BioBrick был введен для преодоления недостатка стандартизации, вызванного традиционными методами молекулярного клонирования . Стандарт сборки BioBrick является более надежным подходом для объединения деталей для формирования более крупных композитов. Стандарт сборки позволяет двум группам синтетических биологов в разных частях мира повторно использовать деталь BioBrick, не проходя через весь цикл проектирования и манипуляций. ^[2] Это означает, что вновь разработанная деталь может быть использована другими группами исследователей более легко. Кроме того, по сравнению со старым методом клонирования ad hoc , процесс стандарта сборки быстрее и способствует автоматизации. ^[11] Стандарт сборки BioBrick 10 был первым введенным стандартом сборки. За эти годы было разработано несколько других стандартов сборки, таких как стандарт Biofusion и стандарт Freiburg.

Стандарт сборки 10 был разработан Томом Найтом и является наиболее широко используемым стандартом сборки. Он включает использование ферментов рестрикции . Каждая часть BioBrick представляет собой последовательность ДНК, которая переносится кольцевой плазмидой , которая действует как вектор . ^[12] Вектор действует как транспортная система для переноса частей BioBrick. Первым подходом к стандарту BioBrick было введение стандартных последовательностей, префиксных и суффиксных последовательностей, которые фланкируют 5 ′ и 3 ′ концы части ДНК соответственно. ^[13] Эти стандартные последовательности кодируют определенные сайты ферментов рестрикции. Префиксная последовательность кодирует сайты EcoRI (E) и Xbal (X), в то время как суффиксная последовательность кодирует сайты SpeI (S) и PstI (P). Префикс и суффикс не считаются частью части BioBrick. ^[3] Для облегчения процесса сборки сама часть BioBrick не должна содержать ни одного из этих сайтов рестрикции. Во время сборки двух разных частей одна из плазмид расщепляется EcoRI и SpeI . Плазмида, несущая другую часть BioBrick, расщепляется EcoRI и Xbal . Это оставляет обе плазмиды с выступами из 4 пар оснований (п. н.) на концах 5 ′ и 3 ′ . Сайты EcoRI будут лигироваться, поскольку они комплементарны друг другу. Сайты Xbal и SpeI также будут лигироваться, поскольку в результате расщепления образуются совместимые концы. Теперь обе части ДНК находятся в одной плазмиде. Лигирование создает сайт «шрама» из 8 пар оснований между двумя частями BioBrick. Поскольку сайт шрама является гибридом сайтов Xbal и SpeI , он не распознается ни одним из ферментов рестрикции. ^[13] Последовательности префикса и суффикса остаются неизменными в результате этого процесса расщепления и лигирования, что позволяет проводить последующие этапы сборки с большим количеством частей BioBrick.

Эта сборка является идемпотентным процессом: множественные применения не изменяют конечный продукт и сохраняют префикс и суффикс. Хотя стандартная сборка BioBrick позволяет формировать функциональные модули, существует ограничение для этого стандартного подхода в 10 пар оснований. Участок рубца в 8 пар оснований не позволяет создавать белок слияния . ^[12] Участок рубца вызывает сдвиг рамки , который препятствует непрерывному считыванию кодонов, что необходимо для формирования белка слияния.

Том Найт позже разработал стандарт сборки BB-2 в 2008 году для решения проблем с соединением рубцов доменов белка и того, что рубцы состоят из восьми оснований, что даст измененную рамку считывания при соединении доменов белка. Ферменты, используемые для переваривания начальных частей, почти те же самые, но с измененными префиксами и суффиксами. ^[14]

Стандарт сборки BglBrick был предложен Дж. Кристофером Андерсоном, Джоном Э. Дьюбером, Марианой Легуйей, Габриэлем К. Ву, Джонатаном К. Голером, Адамом П. Аркиным и Джеем Д. Кислингом в сентябре 2009 года как стандарт, очень похожий по концепции на BioBrick, но позволяющий генерировать белки слияния без изменения рамки считывания или введения стоп-кодонов и при создании относительно нейтрального аминокислотного линкерного рубца (GlySer). Часть BglBrick представляет собой последовательность ДНК, фланкированную 5 ′ сайтами EcoRI и BglII (GAATTCaaaA GATCT ) и 3 ′ сайтами BamHI и XhoI ( G GATCCaaaCTCGAG), и лишенную этих же сайтов рестрикции внутри. Восходящая часть в попарной сборке очищается из переваривания EcoRI/BamHI, а нисходящая часть+вектор очищается из переваривания EcoRI/BglII. Лигирование этих двух фрагментов создает составную часть, преобразуя исходные фланкирующие участки, требуемые в определении части, и оставляя последовательность рубца GGATCT на стыке частей, рубец, который кодирует аминокислоты глицин и серин при слиянии частей CDS вместе в рамке, что удобно, поскольку дипептид GlySer является популярным линкером белковых доменов. ^[2]

Лаборатория Пэм Сильвер создала стандарт сборки Silver для преодоления проблемы, связанной с образованием белка слияния. Этот стандарт сборки также известен как стандарт Biofusion и является улучшением стандарта сборки BioBrick 10. Стандарт Silver включает удаление одного нуклеотида из сайта Xbal и SpeI , что укорачивает сайт рубца на 2 нуклеотида, который теперь образует последовательность рубца из 6 пар оснований. Последовательность из 6 пар оснований позволяет сохранить рамку считывания. Последовательность рубца кодирует аминокислоты треонин (ACT) и аргинин (AGA). ^[15] Это незначительное улучшение позволяет формировать белок слияния в рамке считывания. Однако то, что аргинин является большой заряженной аминокислотой, является недостатком метода сборки Biofusion: эти свойства аргинина приводят к дестабилизации белка по правилу N-конца .

Команда Фрайбурга iGEM 2007 года ^[16] представила новый стандарт сборки для преодоления недостатков существующей стандартной техники Biofusion. Команда Фрайбурга создала новый набор последовательностей префикса и суффикса, введя дополнительные сайты рестриктаз AgeI и NgoMIV в существующие префикс и суффикс соответственно. Эти недавно введенные сайты рестриктаз совместимы со стандартом BioBrick. Стандарт Фрайбурга по-прежнему образует сайт рубца из 6 п.н., но последовательность рубца (ACCGGC) теперь кодирует треонин и глицин соответственно. Эта последовательность рубца приводит к гораздо более стабильному белку ^[17], поскольку глицин образует стабильный N-конец, в отличие от аргинина, который сигнализирует о деградации N-конца. Метод сборки, предложенный командой Фрайбурга, уменьшает ограничения стандарта Biofusion.

При сборке BioBricks используются разные методы. Это связано с тем, что некоторые стандарты требуют разных материалов и методов (использование разных рестриктаз), а другие обусловлены предпочтениями в протоколе, поскольку некоторые методы сборки более эффективны и удобны для пользователя.

Метод сборки 3A является наиболее часто используемым, так как он совместим со стандартом сборки 10, стандартом Silver, а также стандартом Freiburg. Этот метод сборки включает две части BioBrick и целевую плазмиду. Целевая плазмида содержит токсичный (летальный) ген, чтобы облегчить выбор правильно собранной плазмиды. Целевые плазмиды также имеют другие гены устойчивости к антибиотикам, чем плазмиды, несущие части BioBrick. Все три плазмиды расщепляются соответствующим рестриктазой, а затем подвергаются лигированию. Только правильно собранная часть даст жизнеспособную составную часть, содержащуюся в целевой плазмиде. Это обеспечивает хороший выбор, поскольку выживают только правильно собранные части BioBrick.

Метод сборки амплифицированной вставки не зависит от последовательностей префикса и суффикса, что позволяет использовать его в сочетании с большинством стандартов сборки. Он также имеет более высокую скорость трансформации, чем сборка 3A, и не требует, чтобы вовлеченные плазмиды имели разные гены устойчивости к антибиотикам. Этот метод снижает шум от неразрезанных плазмид путем амплификации желаемой вставки с помощью ПЦР перед перевариванием и обработки смеси рестриктазой DpnI , которая переваривает метилированную ДНК, как плазмиды. Удаление шаблонных плазмид с помощью DpnI оставляет только вставку для амплификации с помощью ПЦР. Чтобы уменьшить вероятность создания плазмид с нежелательными комбинациями вставки и остова, остов можно обработать фосфатазой, чтобы предотвратить его повторное лигирование. ^[14]

Метод сборки Gibson без рубцов позволяет одновременно соединять несколько BioBricks. Этот метод требует, чтобы желаемые последовательности имели перекрытие от 20 до 150 пар наносекунд . Поскольку BioBricks не имеют этого перекрытия, этот метод требует праймеров ПЦР для создания свесов между соседними BioBricks. Экзонуклеаза T5 атакует 5' - концы последовательностей, создавая одноцепочечную ДНК на концах всех последовательностей, где различные компоненты предназначены для отжига. Затем ДНК-полимераза добавляет части ДНК в пробелы в компонентах отжига, а лигаза Taq может запечатать конечные нити. ^[14]

Метод сборки 4R/2M был разработан для объединения частей (BioBrick Assembly Standard 10 или Silver Standard) в пределах существующих плазмид (т.е. без ПЦР или субклонирования). Плазмиды реагируют in vivo с ДНК-метилтрансферазами, специфичными для последовательности, так что каждая из них модифицируется и защищается от одной из двух эндонуклеаз рестрикции, которые позже используются для линеаризации нежелательных кольцевых продуктов лигирования. ^[18]

Группа MIT во главе с Томом Найтом, которая разработала BioBricks и Международный конкурс Genetically Engineered Machines (iGEM), также являются пионерами Реестра стандартных биологических частей (Реестр). ^[19] Реестр, являясь одной из основ синтетической биологии, предоставляет веб-информацию и данные о более чем 20 000 частей BioBrick. Реестр содержит:

• Информация и характеристики всех деталей, устройств и систем
• Включает каталог, описывающий функции, характеристики и конструкцию каждой детали.

Каждая часть BioBrick имеет свой уникальный идентификационный код, который упрощает поиск нужной части BioBrick (например, BBa_J23100, учредительный промоутер). ^[2] Реестр находится в открытом доступе, и любой желающий может предоставить часть BioBrick. Большинство заявок на BioBrick поступают от студентов, участвующих в ежегодном конкурсе iGEM, который проводится каждое лето. ^[20] Реестр позволяет обмениваться данными и материалами в режиме онлайн, что позволяет сообществу участников быстро повторно использовать и модифицировать части.

Также были разработаны профессиональные реестры деталей. Поскольку большинство деталей BioBrick представляются студентами в рамках конкурса iGEM, детали могут не иметь важных данных о характеристиках и метаданных, которые были бы необходимы при проектировании и моделировании функциональных компонентов. ^[19] Одним из примеров профессионального реестра деталей является финансируемая государством организация The International Open Facility Advancing Biotechnology (BIOFAB), базирующаяся в США, которая содержит подробные описания каждой биологической детали. Это также реестр с открытым исходным кодом, доступный на коммерческой основе. Целью BIOFAB является каталогизация высококачественных деталей BioBrick для удовлетворения потребностей профессионального сообщества синтетической биологии.

BioBrick Foundation (BBF) — это благотворительная организация, созданная для продвижения использования стандартизированных деталей BioBrick в масштабах, выходящих за рамки конкуренции iGEM. В настоящее время BBF работает над выведением стандартной структуры для продвижения производства высококачественных деталей BioBrick, которые будут доступны всем. ^[21]

• Синтетическая биология
• Мокрое оборудование
• Конкурс iGEM

• Фонд БиоБрикс
• Реестр стандартных биологических частей