Культура клеток на границе раздела воздух-жидкость

Воздушно-жидкостная культура клеток ( ALI ) — это метод клеточной культуры , при котором базальные стволовые клетки выращиваются с их базальными поверхностями в контакте со средой, а верхняя часть клеточного слоя подвергается воздействию воздуха. Затем клетки поднимаются, и среда меняется до тех пор, пока не разовьется мукоцилиарный фенотип псевдостратифицированного эпителия , похожего на эпителий трахеи . ^{[1] [2]}

Этот метод культивирования клеток направлен на изучение фундаментальных аспектов респираторного эпителия, таких как передача сигналов от клетки к клетке , моделирование заболеваний и респираторная регенерация. ^{[1] [2]}

Воздушно-жидкостная культура клеток сравнивается со стандартными методами культивирования клеток, специально нацеленными на восстановление псевдостратифицированной исчерченности дыхательных путей in vitro и нацеленными на поддержание ниши дыхательных путей (сверху вниз) 1) воздуха, 2) псевдостратифицированного эпителия и 3) жидкой среды. Стандартные процессы культивирования клеток либо неспецифичны для дыхательных путей, либо вращаются вокруг системы органов, которая требует других средств поддержания клеток in vitro .

Протокол культивирования на границе раздела воздух-жидкость основан на двух ключевых этапах: изоляции эпителиальных клеток от организма и культивировании этих клеток.

Органы с эпителиальными клетками изолируются ^[1] (препарируются) и помещаются в PBS для очистки от любых примесей, и эти изолированные органы перевариваются с использованием трипсина . После переваривания добавляется ингибитор ROCK ( ингибитор Rho-ассоциированной киназы ) для предотвращения клеточного апоптоза изолированных клеток. Остается переваренное клеточное содержимое, смешанное с тканью; добавляется проназа / ДНКаза для очистки мертвого клеточного материала, а также любого оставшегося белкового материала. Полученный материал мелко измельчается в среде, и отдельные изолированные образцы клеток помещаются в соответственно маркированные микроцентрифужные пробирки и встряхиваются при температуре 37 °C в течение 30–40 минут. После инкубации клеток их высевают на трансвелловые мембраны для роста.

Высевают клетки в среду SABM (базальная среда для малых дыхательных путей) для обогащения клеток питательными веществами для роста и последующей дифференциации . ^[1] После того, как клетки высевают, их выращивают в течение 3–7 дней под тщательным наблюдением (при ежедневной смене среды) до достижения желаемого слияния.

Совсем недавно исследование in vitro генерации пневмоцитов II типа, инициированной из человеческих стволовых клеток CD34(+), продемонстрировало точный метод культивирования клеток на границе раздела воздух-жидкость. ^[3]

Культуры интерфейса «воздух-жидкость» используются во многих исследованиях стволовых клеток , направленных на воссоздание псевдостратифицированного эпителия in vitro . Эти исследования могут способствовать получению новых результатов по различным темам:

При моделировании рака и различных других заболеваний стволовые клетки в базальном слое эпителия трахеи (базальные стволовые клетки) были изолированы и использованы для разработки 3D- органоидов , которые можно было бы использовать для различных исследований, включая исследования опухолей . Используемый метод культивирования клеток включает изоляцию клеток в культуру с факторами роста для роста с течением времени. После того, как клетки были выращены, их смешивали с Матригелем и культивировали для формирования 3D-органоидов. ^{[4] [5]}

При моделировании псевдостратифицированного эпителия in vitro было проведено больше клеточных исследований с целью определения природы клеток – их путей дифференциации, механизма роста и механизма восстановления/реакции в состоянии после травмы. Одно из недавних исследований показало, что дифференцированные клетки в респираторном эпителии ( в первую очередь секреторные клетки и реснитчатые клетки) могут дедифференцироваться в свой наивный статус и снова становиться стволовыми. ^{[1] [5]}

В качестве адаптации к протоколу культивирования на основе интерфейса «воздух-жидкость» были разработаны вспомогательные протоколы с использованием структуры ALI для поддержания свойств наивных стволовых клеток в течение длительных периодов времени. ^[6]