Зингибаин
Фермент цистеиновая протеаза
Зингибаин
PYMOL сгенерировал трехмерную структуру мономера зингибаина
Идентификаторы
Номер ЕС3.4.22.67
Номер CAS246044-91-7
Базы данных
ИнтЭнзIntEnz вид
БРЕНДАзапись BRENDA
ExPASyNiceZyme вид
КЕГГзапись KEGG
МетаЦикметаболический путь
ПРИАМпрофиль
Структуры PDBRCSB PDB PDBe PDBsum
Поиск
ЧВКстатьи
PubMedстатьи
NCBIбелки

Zingibain , zingipain или протеаза имбиря ( EC 3.4.22.67) — фермент цистеиновой протеазы, обнаруженный в корневищах имбиря ( Zingiber officinale ) . [1] [2] [3] Он катализирует преимущественное расщепление пептидов с остатком пролина в положении P2. Он имеет две различные формы : протеаза имбиря I (GP-I) и протеаза имбиря II (GP-II). [4]

Как член семейства папаин-подобных протеаз цистеиновых протеаз, зингибаин имеет несколько структурных и функциональных сходств с более хорошо изученными ферментами, такими как папаин , бромелайн и актинидин . Эти пептидазы содержат активный остаток цистеина в своих центрах, который катализирует гидролитическое расщепление пептидных связей. Зингибаин известен своей активностью в качестве протеиназы и коллагеназы . [1]

Впервые он был выделен, очищен и описан в 1973 году Ичикавой и др. в Японском женском университете . [5] Недавно было обнаружено, что зингибаин существует в виде двух изоферментов , GP-I и GP-II, которые были выделены с помощью хроматографии, с молекулярным весом приблизительно 22 500 Да. [5]

Механизм

Каталитическая триада механистического протеолиза в активном центре зингибана

Зингибаин использует каталитическую триаду остатков Cys, His и Asn в своем активном центре для гидролитического расщепления пептидных связей. Присутствие Asn175 стабилизирует имидазольное кольцо His, гарантируя его оптимальное расположение для катализа гидролиза.

Механизм начинается с переноса протона от Cys25 к His159. [6] Затем сульфид-анион атакует альфа-углерод аминокислоты , вытесняя аминогруппу , которая присоединяется к His159. [6] Затем альфа-углерод на стабилизированной аминокислоте подвергается атаке молекулы воды, которая вытесняет сульфид Cys25, превращая аминокислоту в карбоновую кислоту , которая высвобождается из активного центра фермента. [6]

Экспериментальное введение дитиотреитола , известного защитника тиоловых групп , улучшает протеолитическую активность, обеспечивая дальнейшее подтверждение важности центрального остатка цистеина для ферментативной активности. [7]

Зингибаин показывает максимальную скорость оборота при 60 °C и быстро денатурирует при 70 °C. [8] Протеолиз в значительной степени не затруднен во время приготовления с имбирем. Оптимальные температурные диапазоны папаина и фицина выше относительно зингибаина, тогда как бромелайн работает в несколько более низком диапазоне. [7]

Максимальная протеолитическая активность зингибаина наблюдается при pH 6,0, хотя фермент по-прежнему активен в диапазоне pH от 4,5 до 6,0 (оптимальный pH для мясных маринадов ). [7]

GP-II, более кислый из двух изоферментов, демонстрирует pI 4,82, а GP-I демонстрирует значения pI 5,05 или 5,16. [1] Эти множественные значения pI подтверждают теорию о том, что GP-I может быть смесью двух белков.

Структура

Впервые зингибаин был очищен и охарактеризован с помощью рентгеновской кристаллографии в 2000 году исследователями Бостонского университета . [1]

Фермент состоит из 221 аминокислоты и гликозилирован с 2 N-связанными олигосахаридными цепями в Asn96 и Asn154. [3] Полипептидная цепь зингибаина сворачивается в два полярных домена примерно одинакового размера, разделенных центральной нейтральной щелью. [3] Первый домен содержит альфа-спирали , а второй имеет антипараллельные бета-слои . [3] Такое разделение полярных и неполярных областей облегчает белок-белковые взаимодействия между ферментом и большим диапазоном субстратов. [3]

Активный центр зингибаина, расположенный в центральной щели, имеет глубину 5,5 Å и длину 9,5 Å. [3] Активный центр содержит каталитическую триаду Cys25, His159 и Asn175, которые совместно обеспечивают кислотно-основной катализ.

Зингибаин проявляет специфичность связывания с пептидными субстратами с пролином в позиции P2. [1] Субсайт S2 зингибаина содержит аминокислотную цепочку Trp67-Met68-Asn69-Thr133-Ala157, что делает сайт слишком компактным для размещения более крупных гидрофобных остатков ароматического субстрата, предпочитаемых другими ферментами семейства папаина. [1] Пролин, однако, стабилизируется множественными нековалентными взаимодействиями с этой областью.

Структура фермента стабилизируется водородными связями , а также сшивающими сульфидными связями между тремя парами остатков цистеина (Cys22-Cys63, Cys56-Cys95 и Cys153-Cys200), аналогично многим другим папаинам. [1]

В то время как фермент существует в виде мономера в растворе, кристаллизованный зингибаин образует тетрамеры или димеры димеров, связанные цепями гликозилирования на каждой субъединице. Зингибаин демонстрирует сложные N-связанные олигосахаридные цепи в двух остатках. [1] Цепи имеют длину от 5 до 13 гликозильных единиц и состоят из N-ацетилглюкозамина , фукозы , маннозы и ксилозы . Последовательности сахаров зингибаина почти идентичны олигосахаридам, обнаруженным в лектинах из семян японского дерева пагоды , лакказе a из клеток платана и S-гликопротеинах из Brassica campestris . [1]

Биологическое значение

В корневищах имбиря протеаза имбиря участвует в выполнении множества функциональных ролей по поддержанию и поддержанию жизнедеятельности растительных клеток .

Зингибаин, как и большинство цистеиновых протеаз, синтезируется как пропротеин массой 40-50 кДа в цитоплазматических полисомах , связанных с клеточными мембранами . [9] Внутри эндоплазматического ретикулума эти удлиненные цепи помечены сигналом удержания KDEL ER и помещены в большие везикулы KDEL, которые перемещаются из ER в вакуоли для хранения белка в клеточных стенках . [9]

Зингибаин, вероятно, участвует в хранении белков (в семенах или растительной ткани ), но в основном разрушает и мобилизует запасные белки. Он также может реагировать на абиотические и биотические стрессы, такие как тепловой шок , низкие температуры и обезвоживание , чтобы устранить любые полученные неправильно свернутые или денатурированные белки. [9]

Использует

Размягчитель мяса

Подобно папаину из папайи и бромелаину из ананасов , он используется в качестве размягчителя мяса . [10] [11]

Было показано, что при добавлении зингибаина в готовящееся мясо, обычно в сыром или сушеном имбире, он повышает нежность мяса. [8] [12] Размягчение мяса происходит из-за быстрого протеолиза зингибаином основных мышечных белков в мясе, особенно актомиозина и коллагена I типа , который находится в мышечных суставах . [8]

В то время как другие ферменты папаина, включая папаин, фицин и бромелайн, чаще используются для размягчения мяса, зингибаин демонстрирует схожую или повышенную протеолитическую активность. [11] Фактически, зингибаин является единственной каталогизированной растительной протеазой с коллагенолитической активностью. Зингибаин может быть предпочтительным размягчителем мяса, чем папаин, из-за получаемой в результате текстуры мяса. Хотя папаин может гидролизовать актомиозин, он также расщепляет другие основные тканевые белки, что приводит к кашеобразной текстуре мяса. [11] Специфичность связывания зингибаина обеспечивает преимущественную гидролиз актомиозина и коллагена типа I.

Зингибаин также используется для ароматизации колбас и хлебобулочных изделий . [8]

заменитель сычужного фермента

На протяжении последних 100 лет имбирная протеаза традиционно использовалась для свертывания молока с целью создания имбирного молочного творога , гелеобразного кантонского блюда, приготовляемого из горячего молока и имбирного сока . Способность к свертыванию молока и специфичность имбирной протеазы к протеолизу κ-казеина делают фермент потенциальной заменой растительного сычужного фермента для производства сыра .

Коагуляция молока традиционно осуществляется с помощью коагулирующих ферментов, извлеченных из таких источников, как сычужный фермент. В сычужном ферменте три изофермента химозина гидролизуют κ-казеин, основную фракцию белка в молоке, между Phe105 и Met106 . Гидрофильные субрегионы κ-казеина расщепляются, оставляя после себя в основном гидрофобный агрегат. Таким образом, ферменты дестабилизируют мицеллы κ-казеина и способствуют слипанию гидрофобных остатков белка, заставляя молоко сворачиваться.

К основным промышленным недостаткам сычужного фермента относятся его ограниченные поставки и высокая стоимость, его недоступность для вегетарианцев и практикующих членов некоторых религиозных групп , а также недавние европейские национальные запреты на использование рекомбинантного телячьего сычужного фермента . [13] Грибковые протеазы в значительной степени непригодны в качестве заменителей сычужного фермента, а ферменты из многих растительных экстрактов, как было показано, дают низкий выход, плохую текстуру и горький привкус сыра. [13]

Коммерческие недостатки

Однако сырая имбирная протеаза, извлеченная из экстракта имбиря, нестабильна, ее период полураспада составляет около 2 дней при температуре 5 °C, что делает ее проблематичной для коммерческого применения. [14] Хотя период полураспада фермента не влияет на его эффективность во время приготовления пищи, эта низкая стабильность при хранении требует улучшения для коммерциализации.

Коммерческие попытки стабилизировать фермент для крупномасштабного производства исследовали потенциальные методы инактивации свободной сульфгидрильной группы в активном центре фермента. Механистические возможности включают окисление сульфгидрила, обмен его с дисульфидными мостиками , образование хинон -тиоловых аддуктов или связывание сульфгидрила с ионом тяжелого металла . [14] Было обнаружено, что 0,2% аскорбат натрия стабилизирует зингибаин в течение 14 дней при 5 °C, тогда как сопоставимые концентрации EDTA и CaCl 2 оказали минимальное влияние на стабильность. [14]

Было обнаружено, что зингибаин дезактивируется посредством аутолиза , который можно предотвратить путем реакции активной сульфгидрильной группы с цистеином или PCMB. [14]

Ацетоновые порошки являются жизнеспособным коммерческим методом стабилизации зингибаина. После удаления гидрофобных растительных полифенолов из сырого имбиря вводится ацетоновый порошок при низких температурах для обезвоживания корневой мякоти. [14] Фермент стабилизируется за счет пониженной активности воды, более низких концентраций растительных пигментов и более жестких трехмерных структур при более низких температурах. [14]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ abcdefghi Choi KH, Laursen RA (2000). "Аминокислотная последовательность и гликановые структуры цистеиновых протеаз с пролиновой специфичностью из корневища имбиря Zingiber officinale". Eur. J. Biochem. 267 (5): 1516–26. doi : 10.1046/j.1432-1327.2000.01152.x . PMID  10691991.
  2. ^ Оцуки К., Тагучи К., Сато К. и др. (1995). «Очистка протеаз имбиря с помощью DEAE-сефарозы и изоэлектрического фокусирования». Biochimica et Biophysical Acta (BBA) – Общие предметы . 1243 (2): 181–4. дои : 10.1016/0304-4165(94)00145-н. ПМИД  7873561.
  3. ^ abcdef Choi KH, Laursen RA, Allen KN (1999). "2.1 Структура цистеиновой протеазы с пролиновой специфичностью из корневища имбиря, Zingiber officinale". Биохимия . 38 (36): 11624–33. doi :10.1021/bi990651b. PMID  10512617.
  4. ^ Huang XW, Chen LJ, Luo YB и др. (2011). «Очистка, характеристика и свойства протеаз имбиря по свертываемости молока». J. Dairy Sci. 94 (5): 2259–69. doi : 10.3168/jds.2010-4024 . PMID  21524515.
  5. ^ ab 喜美代, 道; 初世, 佐々; 芳江, 市川 (1973). «ショウガたん白分解酵素の分離精製».栄養と食糧(на японском языке). 26 (6): 377–383. дои : 10.4327/jsnfs1949.26.377 . ISSN  1883-8863.
  6. ^ abc Рыхон М., Хмиэль Д., Стек-Ниемчик Дж. (2004). «Режимы ингибирования цистеиновых протеаз». Акта Биохимика Полоника . 51 (4): 861–73. ПМИД  15625558.
  7. ^ abc Thompson EH, Wolf ID, Allen CE (1973). «Корневище имбиря: новый источник протеолитического фермента». J. Food Sci. 38 (4): 652–655. doi :10.1111/j.1365-2621.1973.tb02836.x.
  8. ^ abcd Lee YB, Sehnert DJ, Ashmore CR (1986). «Размягчение мяса с помощью протеазы корневища имбиря». J. Food Sci. 51 (6): 1558–1559. doi :10.1111/j.1365-2621.1986.tb13860.x.
  9. ^ abc Grudkowska M, Zagdańska B (2004). «Многофункциональная роль растительных цистеиновых протеиназ». Acta Biochimica Polonica . 51 (3): 609–24. doi : 10.18388/abp.2004_3547 . PMID  15448724.
  10. ^ Ха М, Бекхит А.Е., Карне А. и др. (2012). «Характеристика коммерческих препаратов протеазы папаина, бромелайна, актинидина и зингибаина и их активность по отношению к белкам мяса». Food Chem. 134 (1): 95–105. doi :10.1016/j.foodchem.2012.02.071.
  11. ^ abc Ким М., Гамильтон С.Е., Гуддат Л.В. и др. (2007). «Растительная коллагеназа: уникальная коллагенолитическая активность цистеиновых протеаз имбиря». Biochimica et Biophysical Acta (BBA) – Общие предметы . 1770 (12): 1627–35. doi :10.1016/j.bbagen.2007.08.003. ПМИД  17920199.
  12. ^ Moon SS (2018). «Влияние протеолитических ферментов и экстракта имбиря на размягчение M. pectoralis profundus от бычка голштинской породы». Корейский журнал пищевых наук о животных ресурсах . 38 (1): 143–151. doi :10.5851/kosfa.2018.38.1.143. PMC 5932962. PMID  29725232 . 
  13. ^ ab Hashim MM, Mingsheng D, Iqbal MF и др. (2011). «Корневище имбиря как потенциальный источник цистеиновой протеазы, коагулирующей молоко». Фитохимия . 72 (6): 458–64. Bibcode : 2011PChem..72..458H. doi : 10.1016/j.phytochem.2010.12.002. PMID  21353685.
  14. ^ abcdef Адульятам П., Овусу-Апентен Р. (2005). «Стабилизация и частичная очистка протеазы из корневища имбиря ( Zingiber offinale Roscoe)». J. Food Sci. 70 (3): C231–C234. doi :10.1111/j.1365-2621.2005.tb07130.x.
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Zingibain&oldid=1201126236"